應用ELISA檢測青海省部分地區羊衣原體和梭菌抗體

應用ELISA檢測青海省部分地區羊衣原體和梭菌抗體

羊衣原體病是由鸚鵡熱衣原體（Chlamydiapsittaci）引起的一種可在多種動物間廣泛傳播的人畜共患傳染病，牛羊感染後可引起流產（妊娠後期）、早產、死胎及發熱、肺炎、腸炎、多發性關節炎、腦脊髓炎和腹瀉，種公羊發生睾丸炎等廣泛性症候羣[1]。在英國，羊衣原體流產佔所有流產類疾病的比例約為 50%，年損失超過2 000萬英鎊，此外，衣原體病也是引起美國山羊流產的最常見病原[2]。在我國，對羊衣原體病的研究始於1978年，從那時起蘭州獸醫研究所的科研人員就對青海、西藏、內蒙、甘肅等地的羊流產病料進行了分離、鑑定和免疫學研究，調查發現這些地區山羊的流產率高達 20%～25%，而綿羊卻很少發生流產[3-4]。隨後，我國獸醫工作者對國內部分地區羊衣原體病的流行狀況陸續進行了調查研究。楊佔魁等( 2006) 對青海省烏蘭縣改良絨山羊進行了衣原體病的血清學調查，結果陽性率達到14.73%[5]，何成基等(2010)對青海省海北州門源縣、祁連縣、剛察縣和海晏縣1223 份羊血清採用間接血凝試驗進行檢測，結果種公羊血清陽性率為6.18%，生產母羊血清陽性率為8.07%[6]；何存利等(2009)對寧夏各地區的16個規模化羊場進行衣原體病調查，發現羊場的陽性率為100%，羊羣的平均陽性率為 19.3%[7]。由此可見，羊衣原體病在我國部分地區依然形勢嚴峻，必須採取有效的措施進行防制。

羊的梭菌性疾病(clostridiosisi of sheep)是由梭狀芽孢桿菌屬(clostridium)的細菌所引起的一類可造成養羊業重大經濟損失的急性傳染病。這類疾病，具有發病急、病程短、死亡快、死亡率高、臨牀症狀相似、生前診斷困難等特點[8]。羊的梭菌病是由梭菌屬的幾種主要致病性梭菌引起的羊的類急性傳染病。由病敗梭菌引起的叫“羊快疫”。D型魏氏梭菌引起的叫“羊腸毒血癥”，也叫“軟骨病”或“羊快疫”。C型魏氏梭菌引起的叫“羊猝狙”，B型魏氏梭菌引起的初生羔羊梭菌性痢疾，簡稱羔痢。綿羊、山羊、乳山羊均可感染。因本菌為土壤和污水中的常在菌，羊採食被其芽孢污染的飼料和飲食後，芽孢隨之進入消化道，其中一部分被真胃中的胃酸殺死，一部分存活者進入腸道。當胃腸道正常的消化機能受到破壞，尤其是從乾草改吃大量穀物或青嫩多汁富含蛋白質的草料後，瘤胃中正常分解纖維素的菌羣失調，大量未消化的澱粉顆粒經真胃進入小腸，導致該菌迅速繁殖和產生大量的ε毒素和少量的α毒素。這些毒素進入血液，引起毒血癥，使病羊發生休克而死亡。該病有明顯的條件性和季節性。在牧區多發於春末夏初青草萌發和秋季牧草結籽後的一段時期；本病以"歲以內、營養良好、膘情較好的羊只多發和死亡較多。尼羣、李秀英等分別從此病病原的調查、流行現狀、診治、防治措施等方面進行了研究，同時也得出大量關於此病的認識資料、防控措施。調查發現由於我省部分地區對羊梭菌性疾病疫苗接種情況比較好，所以發病率較低，趨於平緩，沒有發生大的浮動，但由此可以看出我省羊梭菌病的存在，而且總體病死率較高[9]。目前，對於該病雖然有多種預防方法，但是任然在許多地方發生，對養羊業造成嚴重損失。

目前，用於檢測羊衣原體和羊梭菌感染的方法很多，如電鏡法、乳膠凝集試驗、聚丙烯酰胺凝膠電泳法(PAGE)等，但因其各自的一些侷限性，很難被廣泛採用，自首次報道建立酶聯免疫吸附試驗（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays, ELISA）以來，由於ELISA具有快速、敏感、簡便、易於標準化等優點，使其得到迅速的發展和廣泛應用 。儘管早期的ELISA由於特異性不夠高而妨礙了其在實際中應用的步伐，但隨着方法的不斷改進、材料的不斷更新，尤其是採用基因工程方法制備包被抗原，採用針對某一抗原表位的單克隆抗體動物脾臟有上百萬種不同的B淋巴細胞系，具有不同基因不同的B淋巴細胞合成不同的抗體。當機體受抗原刺激時，抗原分子上的許多決定簇分別激活各個具有不同基因的B細胞。被激活的B細胞分裂增殖形成效應B細胞進行阻斷ELISA試驗，都大大提高了ELISA的特異性，加之電腦化程度極高的ELISA檢測儀的使用，使ELISA更為簡便實用和標準化，從而使其成為最廣泛應用的檢測方法之一。

鑑此，為了解羊衣原體病和羊梭菌性疾病在我省的分佈及流行情況，為今後制定防疫對策與措施提供一定的參考，在省內選擇三個地區用ELISA檢測方法進行羊衣原體病和羊梭菌性疾病的血清學調查。現將結果報告如下：

1.1 材料

1.1.1 樣品

分別從青海天峻、海晏、海東地區採集羊的血液180份、180份、360份，共720份，以頸靜脈採血，用常規方法分離血清，即將血液樣本放在室温自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集血清，保存過程中如出現沉澱，應再次離心。

1.1.2 ELISA檢測試劑盒

   羊衣原體及羊梭菌檢測試劑盒各4個，內含96孔包被反應板、標準品22.5ng/L、標準品稀釋液、酶標試劑、樣品稀釋液、顯色劑（A液、B液）、終止液、20倍濃縮洗滌液等。加樣器200ul，100ul，50ul各1個；槍頭若干；酶標儀、量筒、燒杯（注：監測過程中所應用到的量筒、燒杯等器皿，均經高壓蒸汽滅菌器15磅20 min滅菌）。此次試驗採用的試劑盒均購於蘭州生物製品研究所，羊衣原體抗體檢測試劑盒生產批號為：DGE93044。羊梭菌抗體試驗試劑盒生產批號為：DGE903042。

1.1.3 洗液

取20mL酶標洗液(濃縮液)，加入到180 mL蒸餾水中，按1:10稀釋。

1.1.4 主要儀器

微量加樣器，微量振盪器，酶標儀，離心機等。

1.2 方法

1.2.1 編號

將樣品對應微孔按序編號，每板應設陰性對照2孔，陽性對照2孔，空白對照1孔，空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其餘各步操作相同。

1.2.2 加樣

分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照50ul。然後在待測樣品孔先加樣品稀釋液40ul，然後再加待測樣品10ul（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加於酶標包被板孔底部儘量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

1.2.3 温育

用封板模封板後置37℃温育30分鐘。

1.2.4 配液

將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液加蒸餾水600ml後備用。

1.2.5 洗滌

小心揭掉封板膜，棄去液體，甩幹，每孔加滿洗滌液，靜置30秒棄去，如此復5 次，拍幹。

1.2.6 加酶

每孔加酶標試劑50ul，空白孔除外。

1.2.7 温育

用封板模封板後置37℃温育30分鐘。

1.2.8 洗滌

小心揭掉封板膜，棄去液體，甩幹，每孔加滿洗滌液，靜置30秒棄去，如此重複5次，拍幹。   

1.2.9 顯色

每孔先加入顯色劑A 50ul，在加入顯色劑B 50ul，輕輕震盪混勻，37℃避光顯色15分鐘。

1.2.10 終止

每孔加終止液50ul終止反應（此時藍色立轉黃色）。

1.2.11 測定

以空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應在加終止液15分鐘以內進行。

1.2.12 結果判定

實驗有效性：陽性對照孔平均值≥1.00，陰性對照孔平均值≤0.10

臨界值（CUT OFF）計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.5

陰性判定：樣品OD值≤臨界值（CUT OFF）鑑為羊衣原體抗體陰性或羊梭菌抗體陰性

陽性判定：樣品OD值≥臨界值（CUT OFF）鑑為羊衣原體抗體陽性或羊梭菌抗體陽性

本次檢樣共涉及全省3個地區，羊衣原體感染共檢測血清樣品720份，檢出陽性樣品43份，平均陽性率為5.83%。其中天峻檢測的180份血清中陽性份有12份，陽性率達6.67%，陽性率為最高；海東地區檢測的360份血清中陽性血清20份，陽性率為5.56%，陽性率為最低，具體結果見表1。羊梭菌感染共檢測血清樣品720份，檢出陽性樣品62份，平均陽性率為8.61%。其中海晏縣檢測的180份血清中陽性有份，陽性率高達12.22%，為被檢地區中陽性率最高；在海東地區檢測的360份血清中陽性數為24份，陽性率為6.67%，為三個地區最低，具體結果見表2。

表1青海省部分地區羊衣原體抗體陽性率統計表

表2青海省部分地區羊梭菌抗體陽性率統計表

3.1 目前對羊衣原體病及羊梭菌病的檢測方法有很多報道[10]，本試驗對羊衣原體病和羊梭菌性疾病的血清學調查採用酶聯免疫分析法，原理是用雙抗原夾心法測定樣品中衣原體抗體水平。用特異性抗原進行包被和製備酶結合物，以檢測相應的抗體，使抗原與某種酶連接成酶標抗原，這種酶標抗原既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體）和酶標抗原按不同的步驟與固相載體表面的抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體複合物與其他物質分開，最後結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物後，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺來進行定性或定量分析。由於酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。

3.2 2009年青海省畜牧獸醫科學院的史紹俊進行了德令哈市絨山羊衣原體病血清學調查,共檢測德令哈市絨山羊血清100份,檢出陽性26份,陽性率為26%[11]。2011年青海省剛察縣畜牧獸醫站的陳國林對剛察縣藏羊血樣 316 份進行檢測，檢出陽性 39 份，陽性率 12.34% [12]。2010年青海省海北州動物疫病預防控制中心的何成基、保善科等對採自海北四縣的 1223 份羊血清，進行了衣原體病的血清學檢測，結果共檢出陽性羊血清 91 份，陽性率為 7.44% [13]。2011年青海省天峻縣畜牧獸醫工作站的張曉強、青海省天峻縣陽康鄉獸醫站的李萬財對天峻縣自然放牧的藏羊羣的316份藏羊血清，進行了衣原體病的血清學檢測，結果共檢出陽性羊血清29份，陽性率為9.18%[14]。本次應用ELISA對共和，青海天峻、海晏、海東地區的720份血清進行檢查陽性率為5.83%，陽性率較以往略有下降，可能的原因有一是也許和青海的地理位置和氣候有關；二是可能處於潛伏期或者是調查不是很廣泛所致；三是我省大多為集約化養殖，在疾病防疫等方面有系統科學的方式方法，減少了各種疫病的發生。通過對羊衣原體病及其病原生物學特性的闡釋流行病學的調查以及診斷方法的總結，現提出對該病進行綜合防治的措施，為今後更好地控制該病的發生提供理論支持：一是加強飼養和管理水平，生產母羊在冬季適當補飼，綿羊和山羊分羣養殖；二是加強山羊和綿羊衣原體病的流行病學調查，建立疫情監測制度，對疑似病例要及時檢驗，尤其對種公羊要加強檢測，清除傳染源; 此外要確定流行株及其生物學特徵，為有效疫苗的研發和防制措施提供指導；三是抗生素治療並不能根除該病，並且會誘導產生耐藥菌株，以最好的辦法是提高檢測方法，使用有效疫苗；四是在衣原體病流行地區，應制定疫苗免疫計劃，定期進行預防接種。

3.3 我國對於羊梭菌性疾病的研究早在80年代，對於其所包含具體病症、發病機理、流行特點、臨牀症狀、病理變化、防治措施等有了一定的瞭解。在2011年新疆烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心王六合等對於他們在1999年和2006年參與診治的二起綿羊和山羊梭菌型疾病引起的羊只死亡病例進行了研究並發表期刊，對羊梭菌性疾病的發病情況、流行特點、診治情況等做了詳細説明，最終結果為是由致病性梭菌引起的羊發病，其特點為病程短、死亡率高、以散發為主[15]；在我省2013年青海省動物疫病預防控制中心李秀英為了解本省羊梭菌病發病狀態及菌苗應用效果情況，掌握疫病發生、死亡和流行規律組織在同仁、門源等7個縣進行了羊梭菌病定點流行病學調查，完成了同仁、門源等7個縣羊梭菌病定點流行病學調查工作並得出報告，報告指出發病時間為1~11月份，呈全年零星發病，發病羊以高原牧區散養為主，農區圈養羊極少發病[16]。我省各縣動物防疫工作重點在重大動物疫病防控工作上，對羊梭菌病等地方流行病不夠重視，把主要的工作精力放在了禽流感、口蹄疫等人畜共患病的防控上，通過全省梭菌病疫情上報情況分析，防控可從以下幾個方面入手：一是應引起足夠重視，加強對梭菌病的免疫，擴大檢測範圍；二是全面均衡加強防控工作；三是在防控上堅持預防為主，強化免疫效果；四是加強飼養管理，消除誘發因素，保持圈舍衞生清潔、乾燥、保暖、通風；五是早確診和治療，防止羊羣羣體發病，造成經濟損失。

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