方法學驗證【多篇】

分析方法的方法學驗證 篇一

一、方法驗證

1．準確度 該指標主要是通過回收率來反映。驗證時一般要求分別配製濃度為80％、100％和120％的供試品溶液各三份，分別測定其含量，將實測值與理論值比較，計算回收率。 可接受的標準為：各濃度下的平均回收率均應在98.0%-102.0%之間，9個回收率數據的相對標準差（RSD）應不大於2.0%。

2．線性 線性一般通過線性迴歸方程的形式來表示。具體的驗證方法為： 在80％至120％的濃度範圍內配製6份濃度不同的供試液，分別測定其主峯的面積，計算相應的含量。以含量為橫座標（X），峯面積為縱座標（Y），進行線性迴歸分析。 可接受的標準為：迴歸線的相關係數（R）不得小於0.998，Y軸截距應在100％響應值的2％以內，響應因子的相對標準差應不大於2.0%。

3．精密度 1）重複性 配製6份相同濃度的供試品溶液，由一個分析人員在儘可能相同的條件下進行測試，所得6份供試液含量的相對標準差應不大於2.0%。 2）中間精密度 配製6份相同濃度的供試品溶液，分別由兩個分析人員使用不同的儀器與試劑進行測試，所得12個含量數據的相對標準差應不大於2.0%。

4．專屬性 可接受的標準為：空白對照應無干擾，主成分與各有關物質應能完全分離，分離度不得小於2.0。以二極管陣列檢測器進行純度分析時，主峯的純度因子應大於980。

5．檢測限 主峯與噪音峯信號的強度比應不得小於3。

6．定量限 主峯與噪音峯信號的強度比應不得小於10。另外，配製6份最低定量限濃度的溶液，所測6份溶液主峯的保留時間的相對標準差應不大於2.0%。

7．耐用性 分別考察流動相比例變化±5％、流動相pH值變化±0.2、柱温變化±5℃、流速相對值變化±20％時，儀器色譜行為的變化，每個條件下各測試兩次。可接受的標準為：主峯的拖尾因子不得大於2.0，主峯與雜質峯必須達到基線分離；各條件下的含量數據（n=6）的相對標準差應不大於2.0%。

8、系統適應性 配製6份相同濃度的供試品溶液進行分析，主峯峯面積的相對標準差應不大於2.0%，主峯保留時間的相對標準差應不大於1.0%。另外，主峯的拖尾因子不得大於2.0，主峯與雜質峯必須達到基線分離，主峯的理論塔板數應符合質量標準的規定。

二、分 析 方 法 驗 證 （Validation）

進行驗證，以證明分析方法符合檢測的目的和要求，這就是分析方法驗證。從本質上講，方法驗證就是根據檢測項目的要求，預先設置一定的驗證內容，並通過設計合理的試驗來驗證所採用的分析方法符合檢測項目的要求。方法驗證在質量控制上有重要的作用和意≮≯義，只有經過驗證的分析方法才能用於藥品生產的分析檢測，方法驗證是制訂質量標準的基礎。 方 法 驗 證 內 容 包括方法的專屬性、線性、範圍、準確度、精密度、檢出限、定量限、耐用性和系統適用性等，檢測目的不同驗證要求也不盡相同。 1. 專 屬 性 （Speciality / Specificity）

專屬性是指分析方法能夠將產品和雜質分開的特性，也稱為“選擇性”。對於純度檢測，可在標準品中加入產品中的已知雜質，或者直接用粗品，考察產品峯是否受到雜質的干擾，對於過程跟蹤，可用反應體系樣品來考察有沒有其它的雜質干擾。必要時使用二極管陣列檢測器或者質譜檢測器進行色譜峯純度檢查。一般要求產品和雜質之間的分離度大於2.0。 2. 線 性 （Linearity）

線性是在設定的範圍內，檢測結果與樣品中原料或產品的濃度呈線性關係的程度。線性是定量檢測的基礎，需要定量檢測的項目都需要驗證線性。一般用貯備液經過精密稀釋，或分別精密稱樣，製備得到一系列被測物質的濃度（5個以上），按濃度從小到大運行序列，以峯面積和濃度的函數作圖，用最小二乘法進行線性迴歸計算，考察分析方法的線性。 3. 範 圍 （Range）

範圍指在能夠達到一定的準確度、精密度和線性時，樣品中被分析物的濃度區間。簡單的説，範圍就是分析方法適用的樣品中待測物的濃度最大值和最小值。需要定量檢測的分析方法都需要對範圍進行驗證，純度檢測時，範圍應為測試濃度的80％～120％。 4. 準 確 度 （Accuracy）

準確度是指測定的結果與真實值之間接近的程度，所以也叫做“真實度”，需要定量得分析方法均需要驗證準確度。準確度應在規定的範圍內建立，對於原料藥可用已知純度的標準品或符合要求的原料藥進行測定，必要時可與另一個已建立準確度的方法比較結果。 5. 精 密 度 （Precision）

精密度是指在規定條件下，同一均勻樣品經多次取樣進行一系列檢測所得結果之間的接近程度。精密度一般用相對標準偏差（RSD）表示，取樣檢測次數應至少6次。 精密度可以從三個層次考察：重複性、中間精密度、重現性。

a、重複性（Repeatability）：是在相同的操作條件下、較短時間間隔內，由同一分析人員測定所得結果的精密度。一般是用100％濃度水平的樣品測定6次的結果進行評價。

b、中間精密度（Intermediate precision）：同一實驗室，在日期、分析人員、儀器等內部條件改變時，測定結果的精密度。 c、重現性（Reproducibility）：指不同實驗室之間不同分析人員測定結果的精密度。

6、檢 出 限 （Limits of Detection；LOD）

檢出限是指樣品中的被分析物能夠被檢測到的最低量，不需要準確定量。檢出限體現了分析方法的靈敏度。檢出限的測定可以通過對一系列已知濃度被測物的試樣進行檢測，以能準確、可靠檢出被測物的最小濃度來確定，也可把已知濃度樣品的信號與噪聲信號進行比較，以信噪比為3：1時的濃度確定檢出限，一般要求能夠達到進樣濃度的0.05%。

7、定 量 限 （Limits of Quantitation / Quantification；LOQ） 定量限是指樣品中的被分析物能夠被定量檢測的最低量，其測定結果需要一定的準確度和精密度，定量限體現了分析方法靈敏定量檢測的能力。檢測需要嚴格控制含量的雜質，必須考察方法的定量限，以保證雜質能夠被準確定量。一般以信噪比為10：1時相應的濃度或進樣量來確定定量限。

8、耐 用 性 （Durability / Robustness）

耐用性是指測定條件發生小的變動時，測定結果不受影響的承受程度，耐用性主要表明方法的抗干擾能力，主要的變動因素包括：流動相的組成、流速和pH值、色譜柱、柱温等。經試驗，應説明小的變動能否符合系統適用性試驗要求，以確保方法有效。 9. 系 統 適 用 性 試 驗 （System Suitability） 液相色譜分析方法主要依賴高效液相色譜儀和色譜柱，在做方法驗證時，有必要將高效液相色譜儀、色譜柱、流動相與實驗操作、待測樣品等一起當作完整的系統進行評估，並將系統適用性作為分析方法的組成部分，系統適用性便是對整個系統進行評估的指標。 一般系統適應性的要求為：分析方法能夠達到0.05%的檢出限；主峯的拖尾因子（T）0.95

分析方法開發與驗證是一個整體，在實際工作中，一般是先開發分析方法，經過適當的優化以後再做方法驗證，驗證的部分內容在分析方法開發時就要做，比如説分析方法的專屬性驗證。分析方法驗證並非必須驗證所有的內容，只要注意驗證內容充分，足以證明分析方法的合理性就可以了，如雜質限度檢測一般只需要驗證專屬性和檢出限，而精密度、線性、定量限等涉及定量測定的項目，則不需要驗證。 有時需要對分析方法進行全面或部分的再驗證。當原料藥合成工藝發生改變時，可能引入新的雜質，雜質檢查方法和含量測定方法的專屬性就需要再進行驗證，以證明有關物質檢查方法能夠檢測新引入的雜質，且新引入的雜質對主成份的含量測定應無干擾。當分析方法發生部分改變時，如檢測波長髮生改變，則需要重新進行檢測限、專屬性、準確度、精密度、線性等內容的驗證，以證明改變後的 分析方法的合理性、可行性

定量分析方法的方法學驗證 篇二

定量分析方法的方法學驗證 定量分析方法的方法學驗證

定量分析方法驗證的目的是證明採用的含量測定方法適合於相應分析要求，在進行定量分析方法學研究或起草藥品質量標準時，分析方法需經驗證。

驗證內容有：線性、範圍、準確度、精密度（包括重複性和重現性）、檢測限、定量限和耐用性等。

一，線性

線性是指在設計的範圍內，測試結果與試樣中被測物質濃度直接呈正比關係的程度。

應在規定的範圍內測定線性關係。可用一貯備液經精密稀釋，製備一系列供試品的方法進行測定，至少製備五份供試樣品；以測得的響應信號對被測物濃度作圖，觀察是否呈線性，再用最小二乘法進行線性迴歸。必要時，響應信號可經數學轉換，再進行線性迴歸計算。迴歸方程的相關係數 （ r ） 越接近於 1 ，表明線性關係越好。

用 UV 法測定時，以對照品配製一定濃度範圍的對照品系列溶液，吸光度 A 一般在 0.3 ～ 0.7 ，濃度點 n ＝ 5 ，用濃度 C 對 A 作線性迴歸，得一直線方程，方程的截距應接近於零，相關係數 r 應大於 0.9999 。

用 HPLC 法測定時，以對照品配製一定濃度範圍的對照品系列溶液 ， 濃度點 n ＝ 5 ～ 7 ，用濃度 C 對峯高 h 或峯面積 A 或被測物與內標物的響應值之比進行線性迴歸或非線性擬合（如 HPLC-ELSD ），建立方程，方程的截距應趨於零，相關係數 r 應大於 0.999 。

線性關係的數據包括相關係數、迴歸方程和線性圖。

二，範圍

範圍係指能達到一定精密度、準確度和線性，測試方法適用的高低限濃度或量的區間。

範圍應根據分析方法的具體應用和線性、準確度、精密度結果及要求確定。對於有毒的、具特殊功效或藥理作用的成分，其範圍應大於被限定含量的區間。

三，精確度

準確度係指用該方法測定的結果與真實值或參考值接近的程度，一般用回收率 （ ％ ） 表示。準確度應在規定的範圍內測試。用於定量測定的分析方法均需做準確度驗證。

1、測定方法的準確度

可用已知純度的對照品做加樣回收率測定，即於已知被測成分含量的供試品中再精密加入一定量的已知純度的被測成分對照品，依法測定。用實測值與供試品中含有量之差，除以加入對照品量計算回收率。

在加樣回率收試驗中須注意對照品的加入量與供試品中被測成分含有量之和必須在標準曲線線性範圍之內；加入的對照品的量要適當，過小則引起較大的相對誤差，過大則干擾成分相對減少，真實性差。

回收率 % = [(C-A)/B]*100%

式中， A 為供試品所含被測成分量； B 為加入對照品量； C 為實測值。

2、數據要求

在規定範圍內，取同一濃度的供試品，用 6 個測定結果進行評價；或設計 3 個不同濃度，每個濃度各分別製備 3 份供試品溶液進行測定，用 9 個測定結果進行評價，一般中間濃度加入量與所取供試品含量之比控制在 l ∶ 1 左右，其他兩個濃度分別約為供試品含量的 80% 和 120% 。應報告供試品取樣量、供試品中含有量、對照品加入量、測定結果和回收率 （ ％ ） 計算值，以及回收率 （ ％ ） 的相對標準偏差 (RSD) 或可信限。

四，精密度

精密度是指在規定的測試條件下，同一個均勻供試品，經多次取樣測定所得結果之間接近的程度。

1、精密度的表示方法

氣相色譜法和高效液相色譜法是對同一供試液進行至少五次以上的測定；精密度一般用相對標準偏差 (relative standard deviation, RSD) 表示： RSD= 標準偏差 /平均值 ′ 100 ％

精密度報告的數據應包括平均值、可信限及相對標準偏差。

一般在一天之內進行的精密度考察稱為日內精密度 (inter-day variability) ；在三天之內進行的精密度考察稱為日間精密度 (intra-day variability) 。

有時為了考察隨機變動因素對精密度的影響，還需設計進行中間精密度試驗，變動因素包括不同日期、不同分析人員和不同設備。

2、重複性（ repeatability ）

是指在同一條件下對同一批樣品，從樣品供試品液製備開始，製備至少六份以上供試品溶液 ( 即 n>6)， 或設計 3 個不同濃度，每個濃度各分別製備 3 份供試溶液，進行測定，計算其含量的平均值和相對標準偏差 (RSD) 。 RSD 一般應根據樣品含量高低、含量測定方法和繁簡進行制訂，如含量很低一般不大於 5 ％；如含量較高，則應從嚴要求。

3、重現性（ reproducibility ）

是指在不同的實驗室由不同分析人員測定結果的精密度。當分析方法將被法定標準採用時，應進行重現性試驗。如建立藥典分析方法時，通過協同檢驗得出重現性結果，協同檢驗及重現性結果均應記載在起草説明中。應注意重現性試驗樣品本身的質量均勻性和儲存運輸中的環境影響因素，以免影響重現性結果。

五，檢測限

檢測限是指試樣中被測物質能被檢測出的最低濃度或量。檢測限是一種限度檢驗效能指標，即反映方法與儀器的靈敏度和噪音的大小，也表明樣品經處理後空白 （ 本底 ） 值的高低。它無需定量測定，只要指出高於或低於該規定的濃度或量即可。根據所採用的分析方法來確定檢測限。

當用 GC 和 HPLC 法時，可用已知低濃度樣品測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，計算出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。一般以 S / N ＝ 2 或 S / N ＝ 3 時的相應濃度或注入儀器的量確定檢測限。檢測限的報告數據應附圖譜，説明測試過程和檢測限結果。

六，定量限

定量限是指樣品中被測物質能被定量測定的最低量，其測定結果應具有一定準確度和精密度。常用信噪比法測定定量限。一般以 S / N ＝ 10 時相應的濃度或注入儀器的量進行確定。

七，耐用性

耐用性係指在測定條件有小的變動時，測定結果不受影響的承受程度，為使方法用於常規檢驗提供依據。開始研究分析方法時，就應考慮其耐用性。如果測試條件要求苛刻，則應在方法中寫明。典型的變動因素有：被測溶液的穩定性，樣品提取次數、時間等。液相色譜法中典型的變動因素有：流動相的組成比例或 pH 值，不同廠牌或不同批號的同類型色譜柱，柱温，流速及檢測波長等。氣相色譜法變動因素有：不同廠牌或批號的色譜柱、固定相，不同類型的擔體，柱温，進樣口和檢測器温度等。薄層色譜的變動因素有：不同廠牌的薄層板，點樣方式及薄層展開時温度及相對濕度的變化等。

經試驗，應説明小的變動能否通過設計的系統適用性試驗，以確保方法有效。

方法學驗證（精選 篇三

主要驗證分析方法的可行性 含量方法學 首先肯定要有系統適用性、溶液穩定性、專屬性、精密度（重複性或中間精密度）、線性、耐用性、準確度、檢測限、定量限

一般一個項目從小試開始、中試、放大 放大最少是三批作為驗證批 驗證批一般內容一般有工藝驗證、清潔驗證、成品檢驗、然後開始穩定性的考察、到穩定性第六個月就可以申報到省局 這個時候就要寫申報資料 質量這塊主要負責

10、11、14號資料（以前版本）現在一般是CTD資料 主要負責3.2.s部分。省局受理後一般一個月後來現考，主要檢查所有的檢驗記錄、儀器使用台賬、對照品使用台賬。通過後有動態批送檢，合格就送到國家局 等批件，這就要很久了 穩定性考察還要繼續進行一般長期到36個月 上面是一個項目的主要流程、製劑還要進行處方篩選，一般在小試、中試是進行、方法學也在這個時候進行（主要含量、有關物質）固體還有釋放度，原料有殘留溶劑、其他已知雜質都要有方法學的支持 針劑也要有處方的篩選、臨牀稀釋液相容性、管道相容性固體分速釋、緩釋、口崩、混懸等這些都不同、從工藝到方法學都不同

實驗室的所有儀器都必須通過驗證、校準才能用、外教一般是華南計量所的每隔一年一次

（液相兩年一次）這中間、每半年應該有一次內部校準、每一年又一次驗證（做了驗證可不做內角）

紫外、紅外也一樣

藥物分析的方法學驗證所要做到的事項 篇四

藥物分析的方法學驗證所要做到的事項

（一）

新藥申報時，藥品質量標準中分析方法必須驗證；藥物生產工藝變更、製劑的組分變更、原分析方法進行修訂時，則質量標準分析方法必須進行驗證；2005版藥典中分析方法驗證指導原則只規定了項目和基本方法而沒有合格標準:附錄XIX A；中國GMP(98)非常關注驗證的過程，分析方法驗證不完善是常見的問題

藥物分析檢驗時藥品生產的GMP的藥物分析的方法學驗證，是保證藥物分析結果準確性的前提和基礎，也是實現藥物分析檢測GMP的必然要素。

構成藥物分析中的檢測方法驗證，這要涉及到以下些方面的內容：

1、分析方法驗證成功的前提條件：

（！）儀器已經確認、校正並在有效期內 （2）經過培訓的人員（3）可靠穩定的對照品

（4）可靠穩定的實驗試劑 （5）確認受試溶液的穩定性，在規定時間內無降解。

2、分析方法學驗證所要求驗證的內容：（1）含量的測定 （2）雜質的含量測定 （3）藥物的定性鑑定 （4）藥物的含量均勻度測定 （5）藥物的微生物檢測 （6）藥物的細菌內毒素的檢測

驗證內容：

準確度：準確度是指用該方法測定的結果與真實值或參考值接近的程度，用百分回收率表示。

測定回收率R（recovery）的具體方法可採用加樣回收試驗法來進行測定。加樣回收試驗已準確測定藥物含量P的真實樣品+已知量A的對照品（或標準品）測定，測定值為M。數據要求:規定的範圍內，至少用9次測定結果評價，如製備高、中、低三個不同濃度樣品各測三次

精密度：（重複性、中間精密度和重現性精密度是指在規定條件下，同一個均勻樣品，經多次取樣測定所得結果之間的接近程度。用偏差（d）、標準偏差(SD)、相對標準偏差(RSD)（變異係數，CV）表示。

（1）重複性(repeatability):在相同條件下，由同一個分析人員測定所得結果的精密度；在規定的範圍內，至少用9次測定結果評價，如製備三個不同濃度樣品各測三次或把被測物濃度當作100%，至少測6次進行評價

（2）中間精密度同一實驗室，不同時間由不同分析人員用不同設備

所得結果的精密度

（3）重現性(reproducibility)不同實驗室，不同分析人員測定結果的精密度

（4）數據要求：需報告SD，RSD和可信限。

專屬性： 指有其他成分（雜質、降解物、輔料等）可能存在情況下采用的方法能準確測定出被測物的特性，能反映該方法在有共存物時對供試物準確而專屬的測定能力，是指該法用於複雜樣品分析時是否受到相互干擾程度的度量

• 通常通過分析含有加了雜質、降解產物、有關化學物質或安慰劑成分的樣品，將所獲分析結果與未加前述成分之樣品的測試結果進行比較，兩組測試結果之差即專屬性

•鑑別反應---應能與可能共存的物質或結構相似化合物區別，不含被分析的樣品，以及結構相似或組分中的有關化合物，均應呈負反應 •含量測定和雜質測定---色譜法和其他方法，應附代表性圖譜，亦説明專屬性。圖中應標明各組份的位置，色譜法中的分離度應符合要求 •雜質可獲得的情況下，對於含量測定，試樣中可加入雜質或輔料，考察測試結果是否受干擾；對於雜質測定，也可向試樣中加入一定量的雜質，考察雜質間是否得到分離

檢測限： 檢測限係指試樣在確定的實驗條件下，被測物能被檢測出的最低濃度或含量。它是限度檢驗效能指標，無需定量測定，只要指出高於或低於該規定濃度即可。

•非儀器分析目視法：用已知濃度的被測物，試驗出能被可靠地檢測出的最低濃度或量

•信噪比法:用於能顯示基線噪音的分析方法（儀器分析方法），是把已知低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，算出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。一般以信噪比3∶1或2∶1時的相應濃度或注入儀器的量確定檢測限

•也可採用標準差法：空白值＝0時；①測定背景10次以上，求出標準差σ

②將σ乘以三倍；③在工作曲線上求出3σ相對應的濃度X，即為方法的檢出值；空白值不等於0；①測定背景10次以上，求出標準差σ；②將σ乘以三倍；③在工作曲線上求出3σ相對應的濃度X；④將求得的對應濃度值加上空白值即得該方法的檢出限

定量限（1imit of quantitationLOQ）

•指樣品中被測物能被定量測定的最低量，結果應具有一定準確度和精密度要求

•常用信噪比法確定定量限，一般以信噪比（S/N）為10∶1時相應的濃度或注入儀器的量進行確定，也可用儀器所測空白背景響應標準差（SD）的10倍為估計值，再經試驗確定方法的實際測定下限 定量限：

指樣品中被測物能被定量測定的最低量，結果應具有一定準確度和精密度要求

•常用信噪比法確定定量限，一般以信噪比（S/N）為10∶1時相應的濃度或注入儀器的量進行確定，也可用儀器所測空白背景響應標準差（SD）的10倍為估計值，再經試驗確定方法的實際測定下限

線性：在設計的範圍內，測試結果與試樣中被測物濃度直接呈正比關係的程度。線形通常用最小二乘法處理數據求得迴歸曲線的斜率（Slope）來表示。數據要求：至少需要五個濃度考察線形，需提供相關係數、y截距（是檢定的可能偏差）、迴歸斜率及方差等參數，應列出迴歸方程數和線性圖

注意：做線性時，應注意儘量做的點多一點、線性濃度範圍寬一點，這樣做的好處是：當你在準確度考察時，你做的回收率考察的濃度就大些，配製溶液時就容易操作些，否者，在你做線性考察時，你做的線性濃度範圍不寬，那麼你在考察回收率時，你採用加入法考察時的濃度變化範圍不寬，操作濃度很難控制，造成實際操作困難。我碰到一個在做方法學研究的人，由於她在考察線性時，做的線性濃度不大，在做回收率時，加入後的量造成回收率濃度超出線性考察範圍的濃度，我説那樣是不行的。因為在做分析計算時又恰恰用了線性關係來計算，結果肯定是值得懷疑，結果是不能令人肯定的！（這是

經驗總結）

範圍：指達到一定精密度、準確度和線性的條件下，測試方法適用的高、低限濃度或量的區間。範圍應根據分析方法的具體應用和線

性、準確度、精密度結果和要求確定。

•原料藥和製劑含量測定範圍為80%-120%；製劑含量均勻度範圍為70%-130%；雜質測定應為被測雜質彙報值到限度的120%；溶出度應為測定範圍的±20%，如規定了限度範圍，應為下限的-20%至上限的+20%，例如緩釋片1h70%，則驗證範圍定為0-90%。耐用性：指測定條件稍有變動時，結果不受影響的承受程度，為常規檢驗提供依據。是衡量實驗室和工作人員之間在正常情況下實驗結果重現性的尺度；如果方法易受到分析條件的影響，或要求苛刻，應註明。典型的變動包括：分析溶液的穩定性，提取時間等。藥物分

析的方法學驗證事項

（二）

含量測定方法驗證的接收標準

？容量分析法：用原料藥精製品(含量>99.5％)或對照品考察方法的精密度，相對標準差一般應不大於0.2％；進行回收率試驗。回收率一

般在99.7～100.3％之間

？UV法：用適當濃度的精製品進行測定，其RSD一般不大於1％。製劑的測定，回收率一般應在98％～102％之間；線性：吸光度A一般在0.2～0.7，濃度點n＝5。用濃度c對A作線性迴歸處理，得一直線方程，r應達到0.9999(n＝5)，方程的截距應近於零含量測定方法驗證的接收標準

？HPLC法：

？要求RSD<2％，回收率98％～102％之間。

？線性範圍：用精製品配製一系列標準溶液，濃度點n應為5～7，用濃度c對峯高h或被測物的響應值之比進行迴歸處理，建立迴歸方

程，r應大於0.999，截距應趨於零

分析方法驗證步驟：

？驗證方案的制訂

？驗證目的、方法改進背景、？提供的原料藥和產品、儀器概要、試劑、對照品

？待驗證的方法，項目，合格標準

？實施人員的培訓

？參考文獻

？驗證的實施

？收集完整的驗證過程記錄和原始圖譜

？複核

？驗證報告

？評價該方法是否通過驗證

方法確認和方法轉移

？對新產品的方法驗證通常在產品開發階段完成；大規模生產後的驗證通常包括方法確認和方法轉移

？分析方法確認是指當國家標準或藥典標準擬變化或已經變化時在本實驗室進行的對所涉及產品是否適用的確認實驗

？確認之前應對新舊方法進行核對，標明所有變更細節

？檢驗樣品的信息（批號、規格)，變更項目的接收標準

？確認試驗的樣品通常包括正常產品、穩定性產品

？方法轉移指檢驗方法由轉移方轉移至接收方時進行的實驗。

？流動相PH（±0.5)

？流動相組成(有機相±5%）

？色譜柱（同一廠家的三個批號，或兩個不同廠家（同固定相和填

充物，尺寸）

？温度（20-25C)和流速(±10%）

？檢測波長（±5nm）

檢驗項目和驗證內容總結

？鑑別試驗除專屬性、耐用性外，其它都不要求。

？雜質的限度檢查除專屬性、檢測限、耐用性外，其它都不要求

？雜質的定量測定除檢測限外，其它都要求。

？含量測定及溶出量測定除檢測限、定量限外，其它都要求

色譜方法學驗證 篇五

色譜方法學驗證

所謂方法驗證（validation，又叫認證）就是要證明所開發方法的實用性和可靠性。實用性一般指所用儀器配置是否全部可作為商品購得（實驗室自己製造的儀器部件就欠實用），樣品處理方法是否簡單易操作，分析時間是否合理，分析成本是否可被同行接受等。可靠性則包括定量的線性範圍、檢測限、方法回收率、重複性、重現性和準確度等。下面就簡單討論這幾個可靠性參數。

1．方法的線性範圍

即檢測器響應值與樣品量（濃度）成正比的線性範圍，它主要由檢測器的特性所決定。原則上。這一線性範圍應覆蓋樣品組分濃度整個變化範圍。線性範圍的確定通常是採用一系列（多於3個）不同濃度的樣品進行分析，以峯面積（或峯高）對濃度進行線性迴歸。當相關係數大於0．99時，就可認為足線性的，小於0．99時，就超出了線性範圍。一個好的GC定量方法，其線性範圍（以FID檢測器為例）可達10；，線性相關係數等於或大於0．9999。

2．方法的檢測限

檢測限(DL)是指方法可檢測到的最小樣品量（濃度）。一般的原則是按照3倍信噪比計算，即氣樣品組分的響應值等於基線噪聲的3倍時，該樣品的濃度就被作為最小檢測限，與此對應的該組分的進樣量就叫做最小檢測量-此外。憶驗證定量方法時，還將10倍信噪比所對應的樣品濃度叫做最小定量限，當用於法規分析時，這一數據應等於或低於法規方法所要求的實際樣品中待測組分的最低允許濃度。

檢測限的測定可用一個接近檢測限濃度的樣品進行分析，據所得色譜峯的峯高來計算。設此時濃度為c、相應的峯高為h（信號強度單位）、基線噪聲為N（與h的單位相同），則檢測限可按下面公式計算：

c／h＝DL/3N；即DL＝3Nc／h 噪聲的大小與儀器的性能，特別是檢測器及其電子電路的穩定性直接相關，也與載氣的純度、色譜柱的性能及操作條件有關。噪聲的測定是在正常操作條件下，儀器穩定時，將信號放大（降低衰減或放大縱座標）來測量，一般是測定樣品出峯前後1min的基線噪聲。

作為分析方法，檢測限無疑是越低越好。為此，應選擇靈敏度高的檢測器，使用高純度的載氣和輔助氣，同時要定期維護儀器，保持進樣口和檢測器的清潔，保持色譜柱的性能。此外，仔細優化分離條件、適當加大進樣量（如採用大體積進樣技術）也是降低檢測限的常用方法。

3．方法回收率

即方法測得的樣品組分濃度與原來樣品中實有濃度的比率。如果樣品未經任何預處理，則回收率一般可不考慮。只有當某些樣品組分被儀器系統不可逆吸附時，回收率才是需要考慮的問題。如果樣品經過了預處理，如萃取工藝，那就必須考慮整個方法的回收率。一般要求回收串大於60％，越接近100％越好。

回收率可用下述簡單方法測定：配置一定濃度的標準樣品，將其兩等分，其中一份按方法步驟進行預處理，然後用GC分析。另一份則不經頸處理而直接用GC分析。兩份樣品所得待測組分峯面積的比率乘以100即是該組分的回收率。有時實際樣品很複雜，特別是樣品基質對預處理的回收率影響較大時，就必須用空白樣品基質（確信不含待測物）製備標準樣品，比如測定廢水中有機農藥殘留量時，就要採用不含農藥的水作空白基質，在其中加入已知量的農藥標準品，然後進行處理和分析。處理後測得的組分含量與處理前加入量的比率乘以100就得到了回收率。

很顯然，回收率太低時會影響方法的檢測限。當樣品處理過程較複雜時，應分步測定回收率，最後針對回收率最低的步驟進行方法改進，以期提高整個方法的回收率。

4．方法重複性和重現性

重現性(reproducibility)足指同一方法在不同時間、地點、不同型號儀器、不同操作人員使用寸所得結果的一致性。與此近似的另一個術語是重複性(repeatability)，常指同一個人在同一台儀器上重複進樣所得結果的一致性。事實上，文獻中二者常常混用，多數人不做嚴格區分。但大多數歐洲學者會嚴格區分二者的不同。我們認為對現代儀器來説，分析重複性是容易實現的，而重現性則是更重要的，也是方法驗證所必須考察的。重現性和重複性都用多次分析所得結果的相對標準偏差(RSD)來表示。

方法的重現性應包括多次連續進樣分析的重複性、不同時間（天與天之間）分析的重複性、不同型號儀器之間的重現性和不同實驗室之間的重現性。作為方法開發人員，首先應測定重複性，即在相同條件下連續進樣5—10次，統汁待測組分的保留時間和峯面積（或峯高）的RSD，一般要求保留時間的RSD不大於1％，峯面積的RSD不大於5%。文獻報道的最佳重複性數據為保留時間的RSD小於0.1%，峯面積的RSD小於1%。

如果樣品要經過預處理，還應測定同一樣品多次處理的重複性。即同一樣品取3—5份做平行處理，看最後測定結果的重複性。這一RSD值應不大於5％。當然，有些工業分析要求不大於10％即可。至於天與天之間的重現性也不應大於10%、

當上述重複性滿足要求後，説明該方法在你的實驗室是可靠的。要將此方法作為標準方法推廣使用，還必須測定不同儀器、不同實驗室之間的重現性。當這些重現性(RSD)都能滿足要求時。這一方法的可靠性就得到了較為滿意的驗證。

方法的線性關係及檢測限

準確稱取 7種目標物的標準品， 用甲醇稀釋配製成 7種目標物的標準溶液， 根據需要用甲醇分別稀釋配製成 5級標準工作溶液， 濃度範圍如表 3所示，在選定的色譜條件下，分別進樣分析。以峯面積為縱座標，濃度為橫座標作迴歸方程，結果見表 3 ， 迴歸方程的相關係數 R2均大於 0.9999,線性關係良好。以最低濃度標樣重複進樣 5次， 取其 3倍標準偏差為檢測限， 10倍標準偏差為定量限， 根據樣品處理過程將結果換算為ug /g ， 得到該方法的檢測限和定量限

方法的回收率和重複性

採用標準加入法測定方法的回收率。取一種已知目標物含量的樣品（ 7 # ） ，加入與其含量相當的混合標

準溶液，重複 5次，測定其加標回收率和重複性， 結果如表 5所示。5次重複實驗的 RSD範圍為 1 。 3 % ~3 。 1 %， 回收率範圍為 97 。 0 % ~ 99 。 6 %， 可以滿足定量需要。

——引自《RP-HPLC法測定煙用香精香料中的7種防腐劑》

內標法方法學注意事項（引自網頁論壇）

選一與欲測組分相近但能完全分離的組分做內標物（當然是樣品中沒有的組分），然後配製欲測組分和內標物的混合標準溶液，進樣得相對校正因子。再將內標物加入欲測組分的樣品中，進樣後測得欲測組分和內標物的定量參數。用內標法公式計算即可。

內標法是將一定量的純物質作內標物，加入到準確稱量的試樣中，根據被測試樣和內標物的質量比及其相應的色譜峯面積之比，來計算被測組分的含量。 選擇內標物有4個要求：1.內標物應是該試樣中不存在的純物質；2.它必須完全溶於試樣中，並與試樣中各組分的色譜峯能完全分離；3.加入內標物的量應接近於被測組分；4.色譜峯的位置應與被測組分的色譜峯的位置相近，或在幾個被測組分色譜峯中間。 內標法的優點是測定的結果較為準確，由於通過測量內標物及被測組分的峯面積的相對值來進行計算的，因而在一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤差。內標法的缺點是操作程序較為麻煩，每次分析時內標物和試樣都要準確稱量，有時尋找合適的內標物也有困難。 外標法簡便，但進樣量要求十分準確，要嚴格控制在與標準物相同的操作條件下進行，否則造成分析誤差，得不到準確的測量結果。

那麼內標法的方法學研究就是將過測量內標物及被測組分的峯面積的相對值，也就是一個比值，來進行一些精密度、準確度、線性之類的研究。

具體就是配製不同濃度的標準溶液，記錄樣品和內標峯面積，計算樣品/內標峯面積比值R樣品/內標，利用樣品濃度C對比值R樣品/內標作直線迴歸，得迴歸方程，作為標準曲線。精密度、準確度也如此。

首先你要了解何為內標法

內標法是一種間接或相對的校準方法。在分析測定樣品中某組分含量時，加入一種內標物質以校誰和消除出於操作條件的波動而對分析結果產生的影響，以提高分析結果的準確度。影響內標和被測組分峯高或峯面積比值的因素主要有化學方面的、色譜方面的和儀器方面的三類。

由化學方面的原因產生的面積比的變化常常在分析重複樣品時出現。 化學方面的因素包括：

1、內標物在樣品裏混合不好；

2、內標物和樣品組分之間發生反應，

3、內標物純度可變等。

對於一個比較成熟的方法來説，色譜方面的問題發生的可能性更大一些，色譜上常見的一些問題（如滲漏）對絕對面積的影響比較大，對面積比的影響則要小一些，但如果絕對面積的變化已大到足以使面積比發生顯著變化的程度，那麼一定有某個重要的色譜問題存在，比如進樣量改變太大，樣品組分濃度和內標濃度之間有很大的差別，檢測器非線性等。進樣量應足夠小並保持不變，這樣才不致於造成檢測器和積分裝置飽和。如果認為方法比較可靠，而色譜固看來也是正常的話，應着重檢查積分裝置和設置、斜率和峯寬定位。對積分裝置發生懷疑的最有力的證據是：面積比可變，而峯高比保持相對恆定， 在用內標法做色譜定量分析時，先配製一定重量比的被測組分和內標樣品的混合物做色譜分析，測量峯面積，做重量比和麪積比的關係曲線，此曲線即為標準曲線。在實際樣品分析時所採用的色譜條件應儘可能與製作標準曲線時所用的條件一致，因此，在製作標準曲線時，不僅要註明色譜條件（如固定相、柱温、載氣流速等），還應註明進樣體積和內標物濃度。在製作內標標準曲線時，各點並不完全落在直線上，此時應求出面積比和重量比的比值與其平均位的標準偏差，在使用過程中應定期進行單點校正，若所得值與平均值的偏差小於2，曲線仍可使用，若大於2，則應重作曲線，如果曲線在鉸短時期內即產生變動，則不宜使用內標法定量。

所以，當你確定應用內標法之後，就不需要進行這些實驗的。因為你在加內標時它就是一個已知濃度了。做方法學的時候，內標和待測物標準品(比如你的白三烯待測物）要分別單獨進樣，然後再做標液的色譜圖（含有內標和樣品），然後再是提取或者回收後的樣品（如血漿或者一些細胞，組織提取物等等），最後比較兩者的封面積。

如果內標選擇用來做方法回收率的，在樣品前處理前進行添加。如果你在做標準曲線時候則上機前添加，添加量不管外標是否為梯度內標量是固定的。你看到有人做實際樣品時候只是在上機前添加內標，他這時候的內標不能指示回收率，只能用於校正儀器信號偏差，通俗的説這種內標叫上機內標。而前處理時候加入的內標叫替代內標。（我這是個人稱呼，不是官方稱呼哈）。添加內標的量，一般要是樣品含量的兩倍，這個，其實很難把握吧，樣品含量我們也不知道，所以就大膽的去加就行了。嘿嘿，純個人觀點哈！