易錯PCR獲得木聚糖酶XYNH突變株篩選

易錯PCR獲得木聚糖酶XYNH突變株篩選

（一）項目簡介

易錯PCR技術是在採用DNA聚合酶進行目的基因擴增時，通過調整反應條件，來改變擴增過程中的突變頻率，從而以一定的頻率向目的基因隨機引入突變，獲得蛋白質分子的隨機突變體。

木聚糖水解酶系是一類降解木聚糖的酶系，包括β-1,4-內切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-D-葡糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酶和酚酸酯酶，可降解自然界中大量存在的木聚糖類半纖維素。

易錯PCR技術獲得木聚糖酶XYNH突變株篩選，是通過易錯PCR技術使木聚糖酶發生突變，從突變株中篩選出木聚糖酶的降解能力、耐熱性、酶活性提高的突變株，這些突變株就是我們所需的突變株。

（二）國內外研究現狀和發展動態

   1.國內外研究現狀

木聚糖酶可以應用在釀造、飼料工業中。木聚糖酶可以分解釀造或飼料工業中的原料細胞壁以及β-葡聚糖，降低釀造中物料的粘度，促進有效物質的釋放，以及降低飼料用糧中的非澱粉多糖，促進營養物質的吸收利用，並因而更易取可溶性脂類成分。

國外對木聚糖酶的研究開始的較早。Sorensen，1955年就對動物瘤胃和土壤中的木聚糖酶進行了研究。1992年就已實現了木聚糖酶的工業化生產。目前國際上研究工作主要集中在對微生物木聚糖酶的誘導與調節機理研究，以及酶的提純、鑑定方法，木聚糖酶基因分子的克隆和表達等（Neeta等，1999；Raffaele等，2004）。自上世紀七十年代末開展木聚糖酶基因的研究工作以來，已有150多種來自真菌和細菌的木聚糖酶基因被克隆並在大腸桿菌中表達。

我國在木聚糖酶方面的研究起步較晚，但發展迅速。上世紀八十年代初期，中國科學院微生物所在張樹政院士(曾宇成等，1987)的帶領下，開始了我國對木聚糖酶的早期研究工作，首次從海棗曲酶（Aspergillus phoenicis）中純化得到了四種木聚糖酶：酶I、酶Ⅱ、酶Ⅲ和酶Ⅳ，並深人研究了活力較高的組分酶Ⅲ的酶學性質。“九五”期間，山東大學微生物技術國家重點實驗室曲音波教授等（曲音波等，2001）開展了木聚糖酶在造紙方面的應用研究，從鹼性假單胞菌sp. G6-2分離出兩種木聚糖酶XynA和XynB。目前，我國對木聚糖酶的研究大多停留在產酶菌株的篩選和馴化、木聚糖酶的純化和理化性質研究方面，部分課題已涉及木聚糖酶的分子生物學研究、木聚糖酶基因克隆、表達和重組。

  2.發展動態

 國內外目前對木聚糖酶的研究，主要是提高木聚糖酶的耐熱性及低温酶活性。

木聚糖酶原酶在國內外市場的發展迅速，佔了酶制市場份額的12%左右。世界上規模化生產木聚糖酶的國家有許多，例如：丹麥、愛爾蘭、芬蘭、日本、加拿大等國家。由於木聚糖酶的半纖維素降解中作用顯著，能夠將半纖維資源在温和條件下轉化為糖，具有很高的經濟價值。所以近幾年來，各國的科研工作者不斷在食品、造紙、飼料、能源與環境等方面研究木聚糖酶的應用技術，並且已經成為各國的科研工作者研究的熱點之一，在這方面做出新的突破。

（三）研究目的

    研究目的是提高木聚糖酶在低温條件下的酶活性。

    木聚糖酶在生物工程中有重要的應用價值，但是生物工程的作用環境往往比較苛刻，所以要求木聚糖酶的物理化學特性比較穩定。如在紙漿和造紙工業中，要生產紙漿需要對木材在高温和較鹼性的環境進行處理，紙漿處理的温度大約在60°C，而處理紙漿所採用的pH值在10-11之間；然而很多木聚糖酶最適作用温度在50-60°C ，在55°C作用半壽期是一個小時。一般情況下，真菌來源的木聚糖酶在pH4-6酸性範圍內起作用；放線菌來源的木聚糖酶和細菌來源的木聚糖酶在pH5-9較廣範圍內起作用。不僅在造紙業中使用的木聚糖酶需要較高的耐熱性和耐鹼性，在釀造、飼料、生物降解以及能源與環境中使用的木聚糖酶也需要較高的耐熱性和耐鹼性。由此看來，在高温和較鹼性pH值有較高活性的木聚糖酶需要比較強烈。所以我們的研究的目的就提高木聚糖酶的耐熱性和耐鹼性。

（四）研究內容

木聚糖是植物細胞中半纖維素的主要成分，佔植物細胞乾重的35%，是一種豐富的生物質資源，是自然界中除纖維素之外含量最豐富的多糖。木聚糖的結構是一種多聚五碳糖，由β-D-1,4木糖苷鍵連接起來，並帶有多種取代基。木聚糖部分降解可形成低聚木糖，徹底降解則得到五碳單糖：木糖、阿魏糖、阿拉伯糖等，其中以木糖為主。

木聚糖水解酶系是一類降解木聚糖的酶系，包括β-1,4-內切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-D-葡糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酶和酚酸酯酶，可降解自然界中大量存在的木聚糖類半纖維素。

木聚糖酶可以應用在釀造、飼料工業中。木聚糖酶可以分解釀造或飼料工業中的原料細胞壁以及β-葡聚糖，降低釀造中物料的粘度，促進有效物質的釋放，以及降低飼料用糧中的非澱粉多糖，促進營養物質的吸收利用，並因而更易取可溶性脂類成分。

從自然界分離的木聚糖酶大多數反應的最適温度為50°C—60°C，來源不同地木聚糖酶在熱穩定性方面存在巨大差異。通常在一定範圍內，酶的反應最適温度與熱穩定性成正比，即反應最適温度高的木聚糖酶其熱穩定性也較好。大部分來源於細菌和真菌的木聚糖酶，其最適反應温度偏低，也不具有能夠滿足工業生產要求的熱穩定性，但研究發現部分放線菌類所分泌的木聚糖酶具有較高的熱穩定性，這在實際生產應用方面具有極大的應用潛力和研究價值。

對那些具有良好熱穩定性的木聚糖酶進行研究，發現多種因素和結構參數能夠對其嗜熱性和熱穩定性產生影響。例如：熱穩定結構域（TSD）、二硫鍵、離子鍵、芳香族氨基酸等因素。

木聚糖酶的水解反應主要為雙替換機理，這與其它糖苷水解酶類的催化機理相似。木聚糖酶中一個穀氨酸（Glu）作為催化劑，另一個穀氨酸（Glu）作為親核試劑，通過兩個穀氨酸（Glu）的酸-鹼機制催化來實現它的水解作用。研究表明木聚糖酶反應的最適pH條件其實是與酸-鹼催化劑周圍的氨基酸的極性或非極性、帶電荷或不帶電荷、帶正電或帶負電這些性質密切相關。

木聚糖酶的酶學性質決定了其在應用上的潛力及應用領域,目前對於木聚糖酶的研究熱點主要有以下幾方面:

1.對木聚糖酶作用的分子機理的瞭解;

2.通過基因工程和蛋白質工程改良木聚糖酶的性質,研製出符合不同應用領域要求的木聚糖酶產品;

3.從天然微生物中篩選性質更為優良的木聚糖酶;

4.採用基因工程手段改良菌種,以獲得更多的高產菌株;

5.優化發酵條件,進一步提高木聚糖酶的合成水平。

現有的國內外文獻關於酶活的測定介紹大多籠統,而且測定方法中各項指標都不統一,同類產品的酶活測定值沒有可比性。因此,本文就木聚糖酶酶活測定及pH值、温度等關鍵因素對酶活測定值的影響進行了進一步的研究,並提出木聚糖酶酶活的測定方法。

（五）創新點與項目特色

   1. 創新點

①木聚糖酶在低温條件下運用於許多方面，所以提高其低温酶活性具有很大發展前景。

②木聚糖水解酶系是一類降解木聚糖的酶系，可降解自然界中大量存在的木聚糖類半纖維素。而木聚糖類纖維素是一種重要的能源，廣泛的存在於自然界中。對木聚糖酶的研究具有很強的前景。

③木聚糖酶應用在生產的許多方面，具有很強的研究開發前景。

④木聚糖酶的來源較為廣泛，可以從細菌、放線菌、真菌以及某些酵母中分離得到。

⑤通過易錯PCR技術，來改變擴增過程中的突變頻率，從而以一定的頻率向目    的基因隨機引入突變，獲得蛋白質分子的隨機突變體。

   2.項目特色

木聚糖酶在自然界分佈廣泛，可從動物、植物和微生物中獲得，因而實驗的原材料來源廣泛。通過易錯PCR技術獲得木聚糖酶XYNH突變株篩選，易錯PCR技術使木聚糖酶發生突變，從突變株中篩選出木聚糖酶的降解能力或者耐熱性提高的突變株，這些突變株就是我們所需的突變株。

易錯PCR技術是在採用DNA聚合酶進行目的基因擴增時，通過調整反應條件，來改變擴增過程中的突變頻率，從而以一定的頻率向目的基因隨機引入突變，獲得蛋白質分子的隨機突變體。 

（六）技術路線、擬解決的問題及預期成果

   1.技術路線 

   2.擬解決的問題

①易錯PCR技術在使木聚糖酶突變產生的不同結果，篩選所需的突變株。

②用水浴法、底物染色法等對酶活性進行測定。

③結合木聚糖酶的特性，進一步對篩選的突變株進行分析。

   3.預期成果

①分離提取木聚糖酶。易錯PCR處理後，篩選出耐熱性提高的木聚糖酶或者有用的突變體，達到有效減少資源的浪費；

②學會測定木聚糖酶的活性；

③通過篩選耐熱性的突變株，瞭解木聚糖酶的耐熱性效應；

④闡明木聚糖酶的提高耐熱性作用機制；

⑤項目後期完成一篇論文並發表；

⑥鍛鍊團隊成員的合作學習與實驗操作的能力；

⑦培訓本團隊成員的科研意識，使他們具有較紮實的微生物學和分子生物學實驗技能，以及較強的科研組織能力；

⑧訓練本團隊成員的創新意識，激發他們創新創業思維。

（七）項目研究進度安排

2016年12月-2017年3月    查文獻，制定研究計劃。

2017年4月-2017年5月    易錯PCR技術處理

2017年6月-2017年9月    篩選木聚糖酶XYHN突變株。

2017年10月-2017年12月  耐熱性的測定及其的研究。

2018年1月-2018年4月    木聚糖酶耐熱性機制的研究 撰寫結題論文。

（八）已有基礎

   1.與本項目有關的研究積累和已取得的成績

申請人及合作者均已學完微生物學、細胞學、微生物實驗等課程，能完成相關的實驗操作，對本課題的研究具有濃厚的興趣。因此，有信心完成本課題的研究。項目指導老師在指導大學生課後科研創新方面具有豐富的經驗，主持或參與的科研項目：湖北省對外科技合作項目(2013BHE016), 2013-2015年；人社部留學人員科技活動擇優資助基金優秀類項目(2008-86), 2008-2010年；科研成果及榮譽2004年入選東湖國家高新區“3551人才計劃”；2016年入選為湖北省科學進步三等獎。所有這些都為本項目的順利完成奠定了堅實的基礎。此外，已有相關木聚糖酶耐熱性研究的報道，這為本項目的順利開展奠定了基礎。

①此之前對木聚糖酶生理功能的研究，各國的科研工作者不斷在食品、造紙、飼料、能源與環境等方面研究木聚糖酶的應用技術，並且已經成為各國的科研工作者研究的熱點之一，在各個方面做出新的突破。在此研究也為此創新提供了思維切入點。

②木聚糖酶可以應用在釀造、飼料工業中。木聚糖酶可以分解釀造或飼料工業中的原料細胞壁以及β-葡聚糖，降低釀造中物料的粘度，促進有效物質的釋放，以及降低飼料用糧中的非澱粉多糖，促進營養物質的吸收利用，並因而更易取可溶性脂類成分。

   2.已具備的條件，尚缺少的條件及解決方法

①已具備的條件

通過前期的實驗課學會一些實驗的動手能力，並在國內核心期刊發表的論文《嗜熱真菌木聚糖酶1YNA及其雙硫鍵突變體在畢赤酵母中的表達》，本項目將在此基礎上，圍繞木聚糖酶的活性產物展開研究。本項目成員已掌握了微生物的分離技術，微生物的培養以及培養基的製備等實驗操作技能，並且掌握了微生物學、PCR擴增技術、轉化技術的理論知識，以及對分子生物學的理論知識有一定了解。本小組成員具有創新精神，能積極地發現問題並提出解決問題的方法，具有團隊合作精神，並能夠堅持不懈。

②尚缺少的條件及解決方法

由於課程安排，本項目成員對分子生物學以及分子生物學分析方法的知識欠缺，所以在整個項目進程中，小組成員會加強對這方面知識的瞭解，不斷查閲文獻，閲讀書籍，以彌補理論知識的欠缺；再者，由於目前接觸的實驗有限，小組成員可能對實驗中某些操作可能會不熟悉，不規範，甚至不會，這就要求在實驗過程中，我們要認真地跟着老師學，虛心地向老師、學長和學姐請教，掌握實驗的操作步驟，並能夠自行解決實驗中出現的問題。