多發性硬化症(MS)

標準的EAE可能不是研究髓鞘再生與軸突完整性的可能關係的理想模型然而，由於炎性脱髓鞘與多發性硬化症高度相關，我們決定尋求一種方法，使免疫反應和退變過程與少突膠質細胞的修復作用脱鈎。

多發性硬化症的脱髓鞘破壞了神經信號，並導致軸突退化。雖然重新髓鞘修復有望恢復喪失的功能，但目前尚不清楚重新髓鞘修復是否能防止軸突丟失。在實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠模型中，炎性脱髓鞘伴隨着顯著的神經元丟失，而在該模型中重新髓鞘形成的證據是持續的炎症、變性和可能的重新髓鞘形成。要證明重新髓鞘形成的功能意義，就必須有選擇地改變與炎症和退變相關的重新髓鞘形成的時間。我們通過直接譜系分析和假設新形成的髓鞘在炎症高峯期保持穩定，證明了EAE誘導後加速了髓鞘再髓鞘形成，部分原因是未成熟髓鞘中沒有MOG的表達。M1受體是少突膠質細胞分化和髓鞘形成的有力負調控因子，其特異性基因消融可加速髓鞘再生，防止軸突丟失，改善功能恢復。綜上所述，我們的研究結果表明，炎性脱髓鞘後加速的髓鞘再生支持軸突的完整性和神經元的功能。

多發性硬化症(MS)的脱髓鞘是以中樞神經系統(CNS)髓鞘為靶點的異常免疫反應所致(Franklin，2002)。在疾病過程中，脱髓鞘軸突經歷不可逆轉的退化，這與疾病的進展相關，並導致永久性殘疾-這些事件是進行性多發性硬化症的病理特徵。到目前為止，還沒有直接預防神經元變性的治療干預措施，特別是在變性的確切機制仍不確定的情況下(Bjartmar和Trapp，2003年；Simons等人，2014年)。作為功能性神經纖維單位的重要附件，髓鞘提供了多層同心膜，以最大限度地提高動作電位的速度和降低能量需求。髓鞘在發育中的中樞神經系統中的重要性被最近的發現進一步説明，這些發現表明少突膠質細胞為神經元提供關鍵的代謝支持(Fu¨nfschilling等人，2012；Lappe-Siefke等人，2003；Lee等人，2012)。然而，儘管在MS這樣的炎症性條件下，髓鞘再分化似乎在保護軸突完整性和恢復神經元功能方面起着至關重要的作用，但缺乏直接的證據。多發性硬化症的再髓鞘形成是一個低效的過程，這可能是由於抑制的微環境阻止少突膠質前體細胞(OPC)終末分化為有髓鞘的少突膠質細胞(Chang等人，2002；Huang和Franklin，2011；Kuhlmann等人，2008；Wolswjk，1998)。此外，人們認為微環境還可能改變OPC的表觀遺傳調控，以改變發育過程中和脱髓鞘後分化所需的轉錄程序(Liu等人，2016a，2016b；Moyon等人，2016；Huynh等人，2014)。為了促進多發性硬化症的髓鞘修復，最近的高通量篩選工作已經確定了一些髓鞘再生化合物(Deshmukh等人，2013年；Mei等人，2014年；Najm等人，2015年；Samanta等人，2015年)。有趣的是，其中一些化合物促進了少突膠質細胞的早熟分化，並減輕了炎性脱髓鞘動物模型EAE的臨牀症狀(Liu等人，2016b；Mei等人，2016；Deshmukh等人，2013年；Najm等人，2015；Samanta等人，2015)。這一現象背後的機制尚不清楚，因為活躍的炎症動態地導致同時發生的脱髓鞘、軸突變性和再髓鞘形成(Miller和Karpus，2007；Nikicét al.，2011；Ransohoff，2012；Stanley和Pender，1991)。要證明髓鞘再生的功能意義，就必須將免疫反應和退變過程從少突膠質細胞介導的修復中分離出來。在這裏，我們通過基因靶向OPC中M1 M受體(Chrm1)的細胞特異性缺失，將重新髓鞘形成與炎症和變性分離，以證明加速的重新髓鞘形成足以降低EAE臨牀評分的嚴重性，部分歸因於保護軸突的完整性。

EAE的脱髓鞘、軸突丟失和再髓鞘形成

為了確定EAE是否適合研究再髓鞘形成和軸突保護，我們對整個EAE過程中脱髓鞘的時間、軸突丟失和重新髓鞘形成的可能性進行了表徵。我們使用MOG肽(MOG35-55)在C57BL/6遺傳背景的小鼠中誘導EAE(Mendel等人，1995年)。小鼠在免疫後14天左右出現慢性癱瘓，並達到最高臨牀評分，一直持續到免疫後30天。為了描述EAE過程中脊髓脱髓鞘的特徵，我們採用了四氧化三銫(OsO4，一種能有效染色髓鞘的親脂過渡金屬)來檢查脊髓白質束上髓鞘的完整性(圖1a-c)。在EAE嚴重程度高峯時，在腰椎脊髓白質束檢測到脱髓鞘病變(圖1b)，隨後在EAE晚期檢測到廣泛的全局性脱髓鞘病變(圖1c)。脊髓橫斷面上的一種髓鞘特異性蛋白MOG的免疫染色也顯示了廣泛的髓鞘損傷(圖1d-f)。值得注意的是，神經絲(NF)染色顯示臨牀嚴重程度高峯時有大量脱髓鞘軸突(MOG陰性區域)(圖1e)，在EAE晚期NF免疫反應顯著喪失軸突，表明神經元顯著變性(圖1f)。透射電鏡下(圖1g-I)，EAE脊髓晚期稀疏見有髓鞘軸突，伴有大量脱髓鞘和可能變性的軸突，胞漿瀰漫染色(圖1h，i)。這些結果表明，EAE模型存在明顯的炎症、脱髓鞘、軸突變性和稀疏的再髓鞘形成。這些發現表明，標準的EAE可能不是研究EAE的理想模型。再生髓鞘形成與軸突完整性之間可能存在聯繫。然而，由於炎性脱髓鞘與多發性硬化症高度相關，我們決定尋求一種方法，使免疫反應和退變過程與少突膠質細胞的修復作用脱鈎。

小分子方法不能明確顯示EAE的再髓鞘形成

為了測試氯馬汀對MOG誘導的EAE的療效，從免疫開始(PI0D)開始每天口服氯馬汀。氯馬斯汀的預防性治療顯著降低了EAE在疾病高峯期和整個慢性期的臨牀嚴重程度(圖2a)。髓鞘再生和軸突丟失通過熒光髓鞘檢測和腰髓NF免疫組織化學染色進行評估(圖2b，c)。氯馬斯汀治療顯著地保留了髓鞘染色強度，並防止了軸突丟失，這是通過EAE晚期白質束中NF免疫染色來評估的(圖2b，c)。為了檢測T細胞、巨噬細胞的浸潤和小膠質細胞的激活，我們對CD3(T細胞)和Iba1(巨噬細胞和小膠質細胞)進行了免疫染色，並對EAE晚期脱髓鞘病變中這些細胞的密度進行了定量(圖2d)。經氯馬斯汀治療後，CD3或IBA1陽性細胞密度未見統計學差異，提示其作用機制不改變細胞浸潤水平的炎症反應(圖2E)。然而，由於組織學提供了一個時間點的靜態圖像，不可能最終確定氯馬斯汀或任何其他小分子是否通過單獨促進髓鞘再生成而導致EAE臨牀評分的減弱。話雖如此，氯馬斯汀仍然有可能調節炎症的其他方面，提供某種軸突支持，甚至穩定髓鞘，從而防止進一步的損害。同樣重要的是要注意，所有這些潛在的影響並不是相互排斥的，它們都可能導致臨牀評分的減弱。

為了確定在EAE模型中氯馬斯汀是否顯著加速了再髓鞘形成，我們利用一種遺傳學方法，通過使用Cspg4-CreErt；MAPT-mGFP系在EAE中檢測了新的髓鞘生成(再髓鞘形成)(圖3a)(Hippenmeyer等人，2005年；Young等人，2013年；Etxeberria等人，2016年)。在這一系中，重組只在NG2細胞(OPC)中被他莫昔芬誘導，新形成的髓鞘(重新髓鞘形成)可以通過膜相關的GFP亞型(MGFP)的表達而被觀察到，因為只有成熟的少突膠質細胞表達tau(圖3a)。我們在免疫和氯馬斯汀治療前兩天用單劑量他莫昔芬誘導重組。在疾病高峯期，攜帶GFP的EAE小鼠中沒有GFP陽性的髓鞘(圖3-數字補充1a)，而在氯馬斯汀治療後，許多GFP陽性的髓鞘可見為圍繞脱髓鞘軸突(NF+/MOG-)的“環”(圖3b)。這些結果直接表明，新形成的髓鞘(有髓鞘軸突)可以在疾病的高峯時期通過髓鞘再生化合物被啟動和鑑定。然而，如果重新髓鞘形成發生在炎症的高峯期，新的髓鞘是如何在這種劇毒的環境中穩定下來的？我們推測，在MOG誘導的EAE模型中，隨着重新髓鞘形成的加速，新的髓鞘還不表達MOG抗原，並將被排除在MOG誘導的炎性脱髓鞘之外。這一點在檢測到一些被薄的綠色熒光蛋白膜包圍的軸突時很明顯，這些軸突的MOG表達仍為陰性(圖3c)。我們還檢測了NG2-CreErt；tau-mGFP小鼠的重組效率，因為我們在賦形劑對照組小鼠中沒有檢測到任何GFP陽性的髓鞘。由於新形成的少突膠質細胞在成年小鼠中不能高頻率產生，我們檢測了14日齡小鼠的重組效率，方法是在出生後第8天給藥他莫昔芬，6天后檢測重組情況。通過檢查出生後第14天髓鞘稀疏的皮質區域，我們量化了GFP陽性、CC1陽性的少突膠質細胞的數量，並計算出重組效率約為少突膠質細胞總數的30%(圖3-圖補充1b)。同樣值得注意的是，我們沒有發現皮質中非CC1陽性的GFP陽性細胞，這表明GFP的表達是少突膠質細胞所特有的。

因此，雖然我們可以使用這種方法來識別EAE中新生成的少突膠質細胞和重新髓鞘形成，但它不一定允許我們識別所有重新髓鞘軸突。儘管髓鞘再分化與臨牀評分的降低是一致的，但目前尚不清楚軸突完整性的保持是否僅僅是由於髓鞘再分化所致，因為沒有一種小分子是細胞類型特異性的，靶外效應可能有助於EAE臨牀評分的降低。Clemastine可能通過拮抗免疫細胞表達的許多受體--包括組胺受體1和毒鼠強受體--來調節免疫系統(Jutel等人，2001年；Johansen等人，2011年)。因此，要將重新髓鞘形成與免疫反應和退化過程的影響分開，需要在不影響其他細胞類型的情況下對OPC進行細胞特異性操作。由於氯馬斯汀已知具有抗毒扁豆鹼的特性，並且在高通量篩選的一系列其他抗毒扁豆鹼化合物中被鑑定出來(Mei等人，2014年)；識別並敲除OPC中的特定靶受體可以明顯複製氯馬斯汀的應用效果，並使我們能夠明確地證明在EAE中髓鞘再分化的神經保護作用。

用於髓鞘再分化的毒鼠鹼受體靶點的鑑定

確定氯馬斯汀的靶受體可能為OPC的細胞特異性操作提供一個理想的策略。氯馬斯汀和苯扎託品是兩種有效的髓鞘再生化合物，它們作用於拮抗6個重疊的靶點，包括5個毒鼠鹼乙酰膽鹼受體亞型(Chrm1-Chrm5)和組胺受體1(HRH1)(Cohen和Almazan，1994；Cohen等人，1996年；de Angelis等人，2012年；Kubo等人，1987；Ragheb等人，2001年)。通過mRNA分析和抗體染色檢測這些受體在少突膠質細胞上的表達。QRT-PCR和免疫染色檢測到OPC在mRNA(圖4-圖形補充1a，b)和蛋白水平(圖4-圖形補充1c，d)中都有Chrm1-Chrm5和Hrh1的表達。由於所有潛在的受體靶點都由OPC表達，儘管表達水平各不相同，我們假設在功能喪失時，M受體(MR)拮抗劑對分化的影響應該被阻斷。為了研究潛在的靶點，從Chrm1-Chrm5或HRH1基因敲除小鼠中系統地純化了OPC。在使用氯馬斯汀、苯扎託品或賦形劑治療後，對MBP陽性的OPC和PDGFRA陽性的OPC的數量進行了量化(圖4a)。治療組歸一化為載體對照組，以揭示MR拮抗劑對個別受體缺失引起的少突膠質細胞分化的影響。正如預期的那樣，氯馬斯汀或苯扎託品在野生型OPC中檢測時，導致OPC數量增加約5倍，OPC數量同時減少(圖4a)。MR拮抗劑在Chrm2-Chrm5或HRH1基因敲除OPC的培養中也觀察到了類似的作用，這表明這些單獨的受體都不是介導MR拮抗劑作用的關鍵(圖4a)。有趣的是，Chrm1基因的敲除完全消除了抗毒扁豆鹼化合物的作用，與載體處理的Chrm1KO細胞相比，導致了類似數量的OPC和分化的OL，這表明Chrm1可能是MR拮抗劑對少突膠質細胞影響的唯一中介(圖4a)。為了確定Chrm1是否足以介導抗毒扁豆鹼類藥物的作用，我們研究了Chrm1缺失是否會複製毒扁豆鹼拮抗劑對OPC分化和髓鞘形成的促進作用。Chrm2-Chrm5或HRH1基因敲除小鼠的OPC表現出與野生型OPC相似的分化(MBP陽性)和增殖(PDGFRA陽性)水平(圖4b，c)。然而，與野生型培養相比，Chrm1基因敲除培養物顯示MBP陽性的OL增加了五倍，OPC的數量顯著減少，這與刪除Chrm1足以促進OPC分化的假設是一致的(圖4c)。

為了測試OPCs是否從Chrm1基因敲除小鼠表現出早熟分化和髓鞘形成，我們將Chrm1基因缺失的OPC與大鼠背根神經節(DRG)神經元進行共培養。我們檢測到骨髓化骨髓化骨肉瘤的數量顯著增加，同時骨髓化骨髓瘤細胞的數量也隨之減少。結果表明，Chrm1在體外對少突膠質細胞的分化和髓鞘形成有很強的負調節作用。

刪除Chrm1作為加速髓鞘再生動力學的一種方法

考慮到Chrm1基因缺失的OPC分化和髓化的內在能力增強(圖4)，我們假設Chrm1基因敲除小鼠的再髓鞘形成動力學將會加速。為了驗證這一假設，我們實施了溶血磷脂誘導的局灶性脱髓鞘模型。6周齡仔鼠脊髓背索和腹外側白質束出現脱髓鞘現象(圖5a)。在這個模型中，重新髓鞘形成是一個涉及OPC招募和分化的過程。根據我們之前的發現，OPC分化和再髓鞘形成發生在損傷後7-14天(DPL)(Fancy等人，2011年；Mei等人，2014年)。因此，我們通過原位雜交和免疫染色分析了在10DPL時少突膠質細胞的分化(圖5b-e)。原位雜交顯示，與野生型小鼠相比，Chrm1基因缺失小鼠皮損中Plp陽性的OL顯著增加(圖5b，d)。此外，病灶的Magin原位雜交(圖5c)和MBP免疫染色(圖5e)均顯示Chrm1基因敲除小鼠在10DPI時OL分化增強。這些發現表明，Chrm1缺失的OPC在脱髓鞘後表現出增強的分化和加速的重新髓鞘形成的動力學。

為了確定Chrm1是否是炎性脱髓鞘後的潛在治療靶點，我們用MOG35-55免疫誘導了性別匹配的Chrm1基因敲除和野生型窩產仔EAE。野生型MOG35-55EAE小鼠在8-14天內出現慢性癱瘓，無明顯緩解期(圖5f)。相比之下，Chrm1基因缺失的EAE小鼠在疾病的最初階段表現出中度的疾病嚴重程度降低，隨後是緩解期，臨牀評分從免疫後19天開始顯著下降(圖5f)。為了測試Chrm1缺失是否促進了EAE小鼠的再髓鞘形成並保護了軸突的完整性，用MOG免疫染色檢測了髓鞘，用NF免疫染色檢測了腰髓中的軸突(圖5g，h)。與野生型EAE小鼠相比，Chrm1基因敲除小鼠的脱髓鞘面積減少(由MOG免疫反應性表示)，提示有重新髓鞘形成和軸突保存(圖5i，j)。為了研究少突膠質細胞以外的細胞中Chrm1的缺失是否有助於防止軸突丟失，我們評估了脊髓中的無髓軸突，這些軸突暴露在與有髓軸突相似的炎症環境中。NAı‘ve野生型和Chrm1基因敲除小鼠脊髓背角內CGRP陽性的無髓軸突密度相近(圖5k，l)。當遭受EAE時，Chrm1基因缺失和野生型小鼠的CGRP陽性纖維密度均顯著降低(圖5k，l)。值得注意的是，CGRP陽性纖維的減少在野生型和Chrm1基因敲除小鼠中相似，表明Chrm1基因缺失並不能挽救無髓軸突免於變性，提示加速的再髓鞘形成可能保護EAE後的軸突免於變性。雖然這些結果表明Chrm1是治療EAE的潛在有效靶點，但我們不能完全排除全局敲除Chrm1可以減輕炎症或以其他方式直接保護軸突的可能性。因此，有必要在OPC中特異性地產生Chrm1的條件性缺失，因為這將允許我們從基因上調節EAE的再髓鞘形成，並將免疫反應和退化過程與少突膠質細胞介導的修復的影響分開。

加速髓鞘再生可防止EAE的軸突丟失

為了確定再生髓鞘是否足以防止炎性脱髓鞘後軸突的丟失，我們通過將Chrm1系與Cnp-Cre系雜交，在OPC中特異性地產生了條件性Chrm1基因敲除小鼠。我們最初檢查了8周齡小鼠的少突膠質細胞發育和髓鞘形成情況，以確定Chrm1CKO小鼠是否會出現髓鞘異常。電鏡觀察顯示，Chrm1CKO(CNP-Cre；Chrm1fl/fl)小鼠與對照(Chrm1fl/fl)小鼠相比，軸突和髓鞘形態相似。我們測量了Chrm1cKO和產仔對照組有髓軸突的G比率(圖6a)。在Chrm1cKO和對照組之間沒有發現明顯的差異(圖6a)。MOG和NF免疫染色顯示Chrm1CKO和對照脊髓的有髓纖維密度相當(圖6b)。此外，分化的少突膠質細胞密度在Chrm1cKO和對照之間沒有明顯變化。

這些結果表明Chrm1 CKO小鼠成年後神經纖維發育正常(圖6)。我們接下來誘導了性別匹配的Chrm1 CKO，Chrm1雜合子的EAE(CNP-Cre；Chrm1fl/+)和MOG35-55免疫控制窩產仔(圖7a)。對照EAE小鼠在10-15天內出現慢性癱瘓，沒有明顯的緩解期(圖7a)。相反，Chrm1CKO小鼠的疾病嚴重程度在早期(PI 13)和整個慢性期(圖7a)都明顯減輕。值得注意的是，Chrm1雜合子小鼠在早期疾病嚴重程度中度降低，隨後進入緩解期，臨牀評分從免疫後22天開始顯著下降(圖7a)。這些結果表明，OPC中Chrm1基因的細胞特異性缺失足以減輕由EAE誘導引起的功能缺陷，並且由於雜合子和純合子小鼠在EAE晚期導致相似的臨牀評分，因此Chrm1失活的這些效應可能是劑量依賴性的。(2)OPC細胞特異性的Chrm1基因缺失足以減輕EAE誘導引起的功能缺陷，並且這些效應可能是劑量依賴性的，因為雜合子和純合子小鼠在EAE的晚期導致相似的臨牀評分。

為了研究這些影響是否是由於重新髓鞘形成和隨後軸突完整性的保存，我們檢查了甲苯胺藍染色的EAE脊髓的半薄切片中的有髓軸突(圖7b，c)。與對照組相比，Chrm1CKO EAE脊髓腹側白質中的有髓軸突密度顯著增加(圖7c)。與對照組相比，在Chrm1CKO EAE脊髓中，MOG和NF的免疫染色顯示MOG免疫反應面積和NF陽性軸突均顯著增加(圖7d-h)。為了確定重新髓鞘形成是否具有神經保護作用並保護Chrm1 CKO小鼠的軸突完整性，我們用電鏡觀察了脊髓腹側白質中的軸突(圖7i，j)。在NAı？ve小鼠中，與先前存在的髓鞘較厚的有髓軸突相比，EAE脊髓中的有髓軸突是通過較薄的髓鞘來識別的(圖7I)。在對照組EAE小鼠中，很容易檢測到脱髓鞘和退化的軸突，其中有一些預先存在的有髓軸突，只有幾個重新髓鞘軸突。相反，在Chrm1CKO EAE脊髓中觀察到的有髓鞘軸突更為一致(圖7J)。接下來，我們量化了EAE脊髓中軸突的比值，重點放在腹側白質上(圖7k)。在Chrm1 CKO EAE脊髓中，無髓鞘軸突的百分比(g比率=1)減少，表明Chrm1 CKO EAE小鼠的再髓鞘形成增強(圖7k)。與Chrm1CKO小鼠相比，EAE對照組小鼠的總有髓軸突密度(每mm2)顯著降低，這表明Chrm1CKO EAE小鼠經歷的軸突變性較少(圖71)。為了確定重新髓鞘形成是否是提高軸突存活率的直接原因，我們通過檢查G-Ratio對預先存在的有髓軸突中的重新髓鞘軸突進行了分類。我們推測，面積比大於0.8的軸突很可能是有髓軸突(圖7k)，因為NAı‘ve脊髓白質中的大多數軸突都表現為低於0.8的有髓軸突(先前存在的有髓軸突)(圖6a)(梅等人，2014年)。EAE組小鼠原有的有髓軸突密度(g-Ratio<0.8)顯著降低，chrm1cko組和對照組eae組小鼠之間無明顯差異，表明opc中chrm1缺失並不影響脱髓鞘的嚴重程度(圖7m)。在對照ı小鼠中檢測到有髓鞘軸突密度(g-ratio>0.8)，並且與NA EAE小鼠相比顯著增加，這表明即使在對照EAE小鼠中，重新髓鞘形成也是一個持續的過程(圖7n)。值得注意的是，與對照EAE小鼠相比，Chrm1CKO小鼠的有髓鞘軸突密度增加了兩倍(圖7n)，表明EAE中的再髓鞘確實具有神經保護作用，不受神經炎性環境的影響。此外，我們通過CD3和Iba1的免疫染色檢測了T細胞、巨噬細胞的浸潤和小膠質細胞的激活，並在EAE後期的Chrm1 cKO和對照仔鼠的脱髓鞘病變中定量了這些細胞的數量(圖7-圖補充1)。我們沒有發現CD3或Iba1陽性細胞在Chrm1CKO和對照仔鼠皮損中的統計差異，這表明Chrm1CKO不會明顯改變炎症反應(圖7-圖補充1)。雖然我們不能排除從OPC中刪除Chrm1可能會改變OPC尚未確定的炎症作用的可能性，但我們的研究結果表明，最有可能的情況是，在炎性脱髓鞘後，重新髓鞘形成在維持軸突完整性方面發揮了因果作用。

討論

軸突變性是多發性硬化症慢性殘疾和進展的基礎，目前無法治療免疫調節途徑在減少復發次數方面有效，可能會影響進行性殘疾的發生時間，但不能完全阻止進展(Carrithers，2014；Rice，2014)。目前，還沒有可用於神經保護的干預措施，特別是因為導致軸突變性的機制還不完全清楚(Bjartmar和Trapp，2003；Sherman和Brophy，2005；Wang等人，2012)。那麼，我們怎樣才能防止炎性脱髓鞘後的軸突變性呢？新出現的證據表明，髓鞘通過在發育中的中樞神經系統提供物理和代謝支持，對於確保軸突的存活非常重要(Hirrlinger和Nave，2014；Morrison等人，2013；Saab等人，2013)。由於重新髓鞘形成在多發性硬化症病變中是一個低效的過程，重新髓鞘形成療法已被提出作為多發性硬化症的一種潛在的治療方法(Franklin和Ffrch-Constant，2008)。為了促進髓鞘修復，最近的高通量篩選工作已經產生了一些髓鞘再生化合物(Deshmukh等人，2013年；Mei等人，2014年；Najm等人，2015年)，有趣的是，其中一些化合物能夠減輕EAE的臨牀嚴重性(Deshmukh等人，2013年；Najm等人，2015年)。然而，我們對髓鞘再生的重要性的有限認識抑制了人們對髓鞘再生方法保護軸突和防止進展的熱情，因為EAE臨牀症狀的減輕也可能歸因於非選擇性藥物治療方法的免疫調節作用。在這裏，我們利用一種遺傳方法，通過特異性地操縱少突膠質細胞而不影響其他類型的細胞，即通過有條件地刪除OPC中的Chrm1，來增強再髓鞘形成。我們的發現首次將EAE中的重新髓鞘形成與活動性炎症和軸突變性分開，並清楚地表明在炎性脱髓鞘條件下，重新髓鞘作用足以維持軸突的完整性和神經元功能。值得注意的是，內源性再髓鞘形成在EAE的高峯期幾乎不存在，只有在後期才能觀察到，這表明細胞自主再髓鞘形成在炎症環境中是一個低效的過程。值得注意的是，正如譜系追蹤所證明的那樣，髓鞘再生方法能夠早在EAE高峯期就開始重新髓鞘形成，並足以拯救軸突免於退化，可能是通過重建對脱髓鞘軸突的代謝和/或物理支持。另外，我們假設有髓軸突被排除在MOG誘導的脱髓鞘之外，部分原因是未成熟的新形成的髓鞘中沒有MOG的表達。這一點在檢測到一些被薄的綠色熒光蛋白膜包圍的軸突時很明顯，這些軸突的MOG表達仍為陰性(圖3c)。此外，儘管在重新髓鞘形成後觀察到了稀薄的髓鞘，但這個過程似乎足以保存大量的軸突。這一證據表明，炎性脱髓鞘後早期髓鞘再分化可能是保護軸突完整性的有效干預措施。綜上所述，我們的發現為炎性脱髓鞘後重新髓鞘形成作為保護軸突完整性和神經元功能的一種手段的功能作用提供了新的見解。我們的研究結果清楚地將OPC上的Chrm1確定為抗毒鼠鹼治療的再髓鞘治療的靶點--表明再髓鞘治療是恢復功能和延長MS患者生活質量的一種有前途的方法。

轉基因小鼠

Chrm1、Chrm2、Chrm3、Chrm4、Chrm5和HRH1基因敲除小鼠(Noubade等人，2007年；Wess，2004年)。Chrm1-Chrm5基因敲除小鼠在C57BL/6遺傳背景上回交至少10代。在Chrm1突變小鼠中，通過用PGK-新黴素抗性盒替換包含Chrm1蛋白的前54個氨基酸的翻譯起始點和編碼區域的基因組片段，Chrm1功能被取消(Gerber等人，2001年)。Chrm1+/-小鼠被雜交產生Chrm1缺失(Chrm1-/-)和野生型(Chrm1+/+)小鼠。Chrm1花小鼠由Susumu Tonegawa(Kamslawa)博士提供。這兩個品系已在C57BL/6遺傳背景下保持了10代以上。Chrm1CKO的育種策略是將Cnp-Cre；Chrm1fl/+與Chrm1fl/fl雜交，產生條件基因敲除純合(CNP-Cre；Chrm1fl/fl)、雜合(CNP-Cre；Chrm1fl/fl)和斜生對照(Chrm1fl/fl)。Cspg4-CreERT2小鼠(朱等人，2011年)由Anders Persson博士(加州大學舊金山分校)和Mapt-GFP記者(Hippenmeyer等人，2005年)小鼠由John Rubenstein博士(加州大學舊金山分校)提供。用聚合酶鏈反應(Pcr)分析所有小鼠的基因型。用合適的引物擴增尾部基因組DNA。所有在這項研究中接受檢查的小鼠都是按照加州大學舊金山分校實驗動物護理管理小組的批准進行處理的。

將他莫昔芬(Sigma-Aldrich，s，MO)以0.5 mg/ml溶於葵花籽油中，在MOG肽免疫前2天口服一劑(40ml)。

少突膠質前體細胞的純化

OPC的免疫泛素純化如前所述(Lee等人，2013年)。簡而言之，OPC是從出生後7-9個大鼠或小鼠的大腦皮層中提純出來的。組織培養皿與山羊抗小鼠IgG和IgM二抗(Jackson Laboratory，Cat：115-005-004)在50 mM Tris-HCl中孵育過夜，終濃度為10 mg ml~(-1)，pH 9.5。用RAN-2、GalC和O4的一抗沖洗培養皿，並在室温下孵育。將齧齒動物大腦半球切成小塊，在37˚C下與木瓜蛋白酶(Worthington)分離，研磨後，將細胞懸浮在淘洗緩衝液中(0.2%牛血清白蛋白)，並在3個免疫平皿上依次孵育：用RAN-2和GalC進行陰性選擇，然後用O4進行陽性選擇。使用0.05%的胰蛋白酶(賓夕法尼亞州匹茲堡的Fisher Science)將OPC從最終的平底盤中釋放出來。OPC在免疫氾濫後通常純度為95%，存活率為94%。

免疫熒光

小鼠用1%戊巴比妥鈉深度麻醉，用4%多聚甲醛在PBS中經心灌注。腦和脊髓在30%蔗糖中脱水，在冰凍切片機(HM450，Thermo)上切片(10 mm或20 mm)。蓋玻片上培養的OPC用4%多聚甲醛固定在PBS中。自由漂浮切片或蓋片切片用20%正常山羊血清封閉，與一抗在4˚C孵育過夜，切片在室温下與二抗孵育1小時。一次抗體包括：大鼠抗髓鞘鹼性蛋白單克隆抗體(1：500，毫孔，貓：MAB395)，兔抗PDGFRA單克隆抗體(1：8000，由lCup贈送)，山羊抗Chrm1(1：100；聖克魯斯生物技術公司，貓：SC-7470)，山羊抗Chrm3(1：100；聖克魯斯生物技術公司，貓：SC-31487)，山羊抗Chrm5(1：100；聖克魯斯生物技術公司，貓：SC-7470)，山羊抗Chrm5(1：100；聖克魯斯生物技術公司，貓：SC-7470)，山羊抗Chrm5(1：100；聖克魯斯生物技術公司，貓：SC-31487)；聖克魯斯生物技術公司，貓：SC-7479)，鼠抗Chrm2單克隆(1：100，abcam，貓：ab90805)，鼠抗Chrm4(1：100，abcam，貓：ab77956)，山羊抗HRH1(1：100，Sigma，貓：SAB2501418)，鼠抗CGRP(1：10,000，abcam，貓：ab81887)，鼠抗CCH1(1：100，Sigma，貓：SAB2501418)。二次抗體包括：AlexaFluor-488-、AlexaFluor-568-或Cy5-偶聯的兔、鼠或山羊二次抗體(1：500；Invitgen)。用DAPI(Vector Labs)鑑定細胞核。髓鞘染色：用氟髓鞘(1：500，Invitgen，Cat：F34651)在PBS中RT孵育20min。

用Trizol(Invitgen，Cat：15596026)從大鼠卵巢上皮細胞培養或大鼠皮質中提取核糖核酸(Invitgen，Cat：15596026)。使用RETROScript逆轉錄試劑盒(Life Technologies，Cat：AM1710)進行逆轉錄。如前所述進行PCR(Mei等人，2016年)。簡而言之，利用基因聚合酶(Invitgen，Cat：10342-020)擴增目的基因。用看家基因3-磷酸甘油醛脱氫酶(GAPDH)的檢測引物和內控引物對每個cDNA樣本進行分析。Forward and reverse primers used for expression analyses are as follows：Chrm1F(agcagcagctcagagaggtc)and Chrm1R(gggcatcttgatcaccactt)；Chrm2F(tcgctccgttatgaatctcc)and Chrm2R(tccacagtcctaacccctac)；Chrm3F(gtgccatcttgctagccttc)and Chrm3R(tcacactggcacaagaggag)；Chrm4F(gacggtgcctgataaccagt)and Chrm4R(ctcaggtcgatgcttgtgaa)；Chrm5F(acagagaagcgaaccaagga)and Chrm5R(ctcagccttttcccagtcag)；Hrh1F(gagcttcgggaagacaagtg)and Hrh1R(ttggcaccttccttggtatc)；and GAPDHF(aggccggtgctgagtatgtc)and GAPDHR(tgcctgcttcaccaccttct).

使用CFX96Touch qRT-PCR系統(Bio-Rad)進行qRT-PCR。用Trizol(Invitgen)從純化的大鼠OPC培養液中提取RNA。用第一鏈cDNA合成試劑盒(PROMEGA)擴增cDNA。熒光染料SYBR Green(羅氏)被包括在每個檢測中，以測量每個退火階段的DNA濃度。用看家基因β-肌動蛋白(β-actin)的檢測引物和內部對照引物對每個cDNA樣本進行三重分析。將每個靶cDNA連續稀釋10倍，繪製稀釋曲線，估計目的cDNA的拷貝數。熒光強度與週期數相對應，並使用β-肌動蛋白進行歸一化，以説明樣品的可變性。用於表達分析的引物如下：Chrm1F(Atcaccacaggcctcctgtc)和Chrm1R(Aagattcatgacagaggcgttg)；Chrm2F(Accctctacactgtgattggcta)和Chrm2R(Ggcccagatgaaggaa)；Chrm3F(Agctggaagcccagtgc)和Chrm3R(gtagctt

用Zeiss Axio Imager Z1熒光顯微鏡或Zeiss LSM-700共聚焦顯微鏡採集少突膠質細胞及其共培養細胞的熒光圖像，激發波長分別為Alexa Fluor 488(488 Nm)、596(568 Nm)、647(628 Nm)或DAPI(380 Nm)。為了進行統計分析，從每口井中隨機採集了至少三個代表性區域(20倍)。使用Zen軟件(Zeiss)和Image-Pro Plus軟件5.0(Media Cybernetics，Silver Spring，MD，USA)進行檢測和定量。

在電鏡下，動物先用0.1M pH 7.4的醋酸鈉沖洗，然後用1.25%的戊二醛和2%的多聚甲醛在0.1M的pH 7.4中灌流。然後，組織在格拉德斯通研究所(UCSF)的電子顯微鏡核心設施中進行處理。組織在相同緩衝液中後固定在2%四氧化二釤中，用2%醋酸鈾酰封閉和染色，在丙酮中脱水，滲透幷包埋在LX-112樹脂(Ladd Research Industries，Burlington，VT)中。半薄切片甲苯胺藍染色。樣品在Reichert Ultracut S超微切片機上超薄切片，用0.8%檸檬酸鉛反染色。在JEOL JEM-1230透射電子顯微鏡(JEOL USA，Inc.，Peabody，MA)上檢查網格，並用Gatan超聲波1000數碼相機(Gatan Inc.，Warrendale，PA)拍攝。用Image-Pro Plus軟件測量軸突直徑與軸突直徑與髓鞘軸突直徑的比值，計算有髓纖維的G比值。在所有情況下，對三對小鼠的電子顯微照片進行了測量。

脊髓切片用2%戊二醛0.1M PBS，pH7.2後處理1h。樣品在PBS中漂洗，切片用0.1%的OsO4在PBS中RT孵育45min

OPC-DRG共培養物的製備如前所述(Mei等人，2014、2016)。簡單地説，從E15 Sprague-Dawley大鼠分離、培養DRG神經元(每25 mm蓋玻璃150,000個細胞)，並在含有100ngml-1 NGF(Abd Serotec)的膠原包被蓋玻片上純化。神經元維持3周，並在種植OPC之前廣泛使用DMEM(Invitgen)清洗以去除任何殘留的NGF。共培養物在DMEM(Invitgen)+B27(Invitgen)、N2(Invitgen)、青黴素-鏈黴素(Invitgen)、N-乙酰半胱氨酸(Sigma-Aldrich)和Forskolin(Sigma-Aldrich)的化學培養基中培養。

如前所述，在8周齡野生型和Chrm1缺失型仔鼠的脊髓背索和腹外側白質區域誘導了脱髓鞘損傷(Chong et al.，2012)。簡單地説，動物用異氟烷和丁丙諾啡麻醉，脊髓暴露在t12/13水平。0.5ml 1%溶血磷脂酰膽鹼(l-a-溶血磷脂酰膽鹼)。在每個病變部位用漢密爾頓針注射。注射4只野生型小鼠和4只Chrm1基因缺失小鼠，10dp.l後進行分析。

在8-10周齡的雌性C57BL/6小鼠(Jackson Lab，Cat：000664)皮下注射100 mg的髓鞘少突膠質細胞糖蛋白多肽(氨基酸35-35；Auspep)，其中完全弗氏佐劑含2 mg/ml的滅活結核分枝桿菌H37RA(DIFCO)。200 ng百日咳毒素(LIST生物實驗室公司)。MOG35-55誘發的EAE小鼠每天灌胃氯馬斯汀10 mg/kg(PBS中含10%二甲基亞碸)或等體積的溶媒，分別於第0天和第2天腹腔注射氯馬斯汀10 mg/kg(含10%二甲基亞碸的PBS)或等量的溶媒。對Chrm1KO或Chrm1CKO小鼠或C57BL/6遺傳背景的野生型對照小鼠(C57BL/6)，用100 mg的少突膠質細胞糖蛋白(MOG)肽(氨基酸35~55；Auspep)和200 ng百日咳毒素免疫8~10周齡的雄性和雌性小鼠，在第0天和第2天誘導EAE。用33 mg重組小鼠MOG(RmMOG)蛋白免疫Cspg4-CreErt；Tau-GFP小鼠。每天給小鼠評分如下：0=無體徵；0.5=尾巴遠端無力；1=尾巴無力；1.5=背部翻轉時不能立即轉向；2=蹣跚行走；2.5=雙側後肢癱瘓；3=嚴重雙側後肢癱瘓伴一側後肢癱瘓；3.5=雙側後肢癱瘓；4=開始前肢癱瘓；4.5=嚴重前肢癱瘓(動物被實施安樂死)；5=垂死

對EAE實驗的臨牀數據進行統計分析，使用Mann-Whitney檢驗來檢查個別日期。另外，使用雙尾學生t檢驗來確定與對照培養物或對照小鼠(載體或野生型)相比，表示為*或#p<0.0 5，**或##p<0.0 1或*p<0.001的顯著性。研究人員在EAE實驗中對基因敲除小鼠的分配視而不見，直到最後的統計分析。